紫杉醇對(duì)SHI－1細(xì)胞株增殖抑制及凋亡的影響

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（揚(yáng)州大學(xué)附屬泰興醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.血液科，江蘇泰興225400）

近年來(lái)新技術(shù)、新的抑癌藥物不斷涌現(xiàn)，但復(fù)發(fā)、難治性白血病的治療，仍然是個(gè)難題。紫杉醇作為一種新一代植物堿類(lèi)抗腫瘤藥物，主要是通過(guò)作用于微管系統(tǒng)而抑制細(xì)胞分裂，被廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、黑素癌、肺癌的治療。現(xiàn)將本研究通過(guò)體外觀察紫杉醇對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株SHI－1的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及誘導(dǎo)分化的作用報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SHI－1由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院、江蘇省血液研究所惠贈(zèng)；紫杉醇為江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)產(chǎn)品；IMDM培養(yǎng)基為賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；DNA倍體分析試劑盒、異硫氰酸熒光黃（Annexin－V－FITC）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞 凋 亡 試 劑 盒、JC－1（5，5′，6，6′－tetrachloro－1，1′，3，3′－tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SHI－1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，置37℃、飽和濕度、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2～3d更換培養(yǎng)液1次或根據(jù)培養(yǎng)液的顏色進(jìn)行更換。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力和形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105／mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中，每孔1mL，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再分別加入不同濃度的紫杉醇，使紫杉醇的終濃度分別為5、0.5、0.05、0.005mg／L組，同時(shí)設(shè)不加藥物的空白對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48h。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌2次后，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)直接染色2～10min，在顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。每次計(jì)數(shù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活率＝［活細(xì)胞數(shù)／活細(xì)胞＋死細(xì)胞數(shù)］×100%。取空白對(duì)照組和藥物作用后的各組細(xì)胞先在倒置顯微鏡下觀察，再將細(xì)胞懸液離心涂片，用瑞氏姬姆薩染色液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 DNA倍體分析 取各組經(jīng)過(guò)藥物處理后的細(xì)胞懸液檢測(cè)DNA倍體。加入20μL PI染液，避光孵育30min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析后用Modfit軟件進(jìn)行DNA倍體分析，計(jì)算出各期細(xì)胞的百分比。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V／PI標(biāo)記染色測(cè)定凋亡細(xì)胞 取24孔板中的各組經(jīng)過(guò)藥物處理后的細(xì)胞懸液，采集1×106個(gè)細(xì)胞，用冷PBS液洗1遍后再0℃水浴，加入400μL結(jié)合緩沖液后，輕輕混勻細(xì)胞后加入5μL Annexin V－FITC和5μL PI液，避光孵育15min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制時(shí)效曲線。

1.2.5 JC－1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體跨膜電位（△Ψm） 將2×105／mL細(xì)胞懸液加入JC－1熒光染液5μL充分混勻，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，避光孵育20min，離心去除上清液并用PBS液洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以BD公司FACSDiva軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡下觀察紫杉醇誘導(dǎo)SHI－1細(xì)胞凋亡 倒置相差顯微鏡下，空白對(duì)照組SHI－1細(xì)胞呈梭形，形態(tài)均一，可成簇生長(zhǎng)。較低濃度的紫杉醇藥物組可觀察到SHI－1細(xì)胞皺縮變小、胞體變圓，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，未見(jiàn)細(xì)胞成簇生長(zhǎng)。經(jīng)瑞氏姬姆薩染色油鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)核固縮、核邊聚、核碎裂，胞膜出泡，并可見(jiàn)典型的凋亡小體等。

2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 紫杉醇作用于SHI－1細(xì)胞后，隨著作用劑量和時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖率明顯受到抑制，細(xì)胞活率也顯著減少，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的量效關(guān)系（圖1）。

2.3 紫杉醇對(duì)SHI－1細(xì)胞凋亡的影響和對(duì)SHI－1線粒體跨膜點(diǎn)位（△Ψm）的影響 見(jiàn)表1～2。紫杉醇對(duì)SHI－1細(xì)胞周期的影響見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度紫杉醇作用SHI－1細(xì)胞存活率

圖2 0.05mg／L濃度的紫杉醇對(duì)SHI－1細(xì)胞周期的影響

表1 紫杉醇作用12、24、36、48h后SHI－1細(xì)胞的凋亡率比較（n＝3，%，±s）

表1 紫杉醇作用12、24、36、48h后SHI－1細(xì)胞的凋亡率比較（n＝3，%，±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組和0.005mg／L組比較。

凋亡率組別2.25±0.38 2.44±0.40 2.68±0.36 2.87±0.42 0.005mg／L組 2.77±0.45 2.89±0.49 3.04±0.44 3.99±0.40 0.05mg／L組 6.40±0.49＊ 18.51±0.87＊ 27.33±0.99＊ 33.72±1.12＊0.5mg／L組 6.70±0.54＊ 19.02±0.84＊ 28.04±1.02＊ 35.98±0.98＊5mg／L組 5.91±0.39＊ 13.44±0.75＊ 26.01±1.15＊ 27.20±1.22 12h 24h 36h 48h對(duì)照組＊

表2 紫杉醇作用SHI－1細(xì)胞ΔΨm的影響（±s）

表2 紫杉醇作用SHI－1細(xì)胞ΔΨm的影響（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組和0.005mg／L組比較。

降低細(xì)胞的比例（%）組別6.41±0.13 8.82±0.18 10.22±0.15 12.82±0.22 0.005mg／L組 8.92±0.24 13.84±0.36 14.83±0.34 18.50±0.45 0.05mg／L組 10.63±0.28＊ 25.50±0.24＊ 30.29±0.35＊ 60.13±0.43＊0.5mg／L組 12.51±0.44＊ 41.92±0.47＊ 49.25±0.40＊ 70.23±0.51＊5mg／L組 21.44±0.38＊ 60.51±0.55＊ 61.62±0.58＊ 78.05±0.48 12h 24h 36h 48h對(duì)照組＊

3 討 論

紫杉醇是一種廣譜抗癌藥，對(duì)普通抗癌藥物耐藥的某些晚期腫瘤有良好的療效，對(duì)多種臨床惡性腫瘤療效顯著。近年來(lái)，隨著細(xì)胞凋亡研究的深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到抗腫瘤藥主要是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用，能否誘導(dǎo)凋亡以及凋亡的程度已成為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的重要指標(biāo)［1］。白血病的誘導(dǎo)分化和凋亡療法逐步成為白血病的兩個(gè)新治療策略［2］。有研究證實(shí)，紫杉醇抗腫瘤的機(jī)制之一是通過(guò)抑制細(xì)胞微管解聚，使細(xì)胞停滯在有絲分裂期，在G2／M期中發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用［3］。此外，還具有提高宿主細(xì)胞免疫力和誘導(dǎo)腫瘤壞死的作用［4］。本研究中SHI－1細(xì)胞株是由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院、江蘇省血液研究所建立，建自一例臨床表現(xiàn)呈高度耐藥的急性單核細(xì)胞白血病患者，被證實(shí)對(duì)多種化療藥物耐藥［5］。有研究表明，以P糖蛋白（P－gP）為代表的某些三磷酸腺苷結(jié)合蛋白超家族成員以及某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子表達(dá)水平升高是很多化療藥物誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的直接原因［6－7］。雖然已有體外實(shí)驗(yàn)表明紫杉醇對(duì)白血病細(xì)胞株有增殖抑制作用［8－9］，但尚未有人研究其治療難治性白血病的作用。

本研究結(jié)果表明，不同濃度的紫杉醇作用于SHI－1細(xì)胞株12、24、36、48h，細(xì)胞活力均有不同程度下降，以48h更為明顯。紫杉醇對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其中，0.005 mg／L組對(duì)SHI－1細(xì)胞株增殖抑制作用較弱，隨時(shí)間增加，其抑制率增大緩慢；0.05mg／L組對(duì)SHI－1細(xì)胞株增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用最為顯著。本研究觀察到藥物濃度加大后，壞死細(xì)胞逐漸增多。因此，本研究認(rèn)為，從凋亡的角度看誘導(dǎo)SHI－1細(xì)胞凋亡應(yīng)選擇適合的藥物濃度和作用時(shí)間，這樣可使正常細(xì)胞避免藥物過(guò)大劑量和超長(zhǎng)的作用時(shí)間帶來(lái)的損害，任意提高藥物濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是無(wú)益的［10］。

根據(jù)紫杉醇臨床常規(guī)用藥的劑量范圍為135～175 mg／m2，按文獻(xiàn)［11］推薦的公式計(jì)算，其在體內(nèi)血漿中的濃度為89～116μg／mL，而本實(shí)驗(yàn)所采用的紫杉醇濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該水平。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度紫杉醇較高濃度更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)紫杉醇臨床治療劑量的制定具有一定的參考價(jià)值。若在臨床中使用紫杉醇治療難治性白血病，可從小劑量開(kāi)始，其臨床療效及不良反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

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