六味地黃湯通過缺氧誘導因子1α途徑對5／6腎切除大鼠腎間質纖維化的抑制作用＊

唐 群，何澤云，陳 麗，徐文峰，曾海飛

（1.湖南中醫藥大學，長沙410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙410007）

研究指出，腎小管間質部分的慢性氧缺失是促進腎臟疾病進展和纖維化的重要原因［1］。體外實驗證明，缺氧可刺激腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉分化，參與腎間質纖維化的發生、發展［2］，缺氧主要通過缺氧誘導因子1α（hypoxia－inducible factor 1α，HIF－1α）發揮作用［3］，后者可調控結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達。現將本研究探討HIF－1α在慢性腎間質纖維化中的作用以及六味地黃湯對其表達的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠30只，體質量（200±10）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供并飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物房。

1.1.2 藥物 六味地黃湯（熟地黃24g，山藥12g，山茱萸12 g，澤瀉9g，茯苓9g，牡丹皮9g）購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。先將藥材用相當于藥材5倍的自來水浸泡2 h，煮沸后再微火煎熬30min，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水煎煮，取二煎液。將兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮藥液至含生藥1g／mL。

1.1.3 主要試劑 一抗為兔抗大鼠HIF－1α、CTGF多克隆抗體（美國Santa Cruz），兔二步法檢測試劑盒（PV－6001）、二抗為非生物素標記山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司），ECL化學發光試劑（美國Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 SD雄性大鼠適應性喂養1周后隨機分為假手術組（10只）、模型組（10只）和六味地黃湯組（10只）。假手術組打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟，不切除腎臟。模型組、六味地黃湯組大鼠均在無菌條件下進行5／6腎切除術，以10%水合氯醛0.30mL／100g腹腔注射麻醉大鼠，常規消毒鋪巾，從左腹部切口，打開腹腔，靜脈夾夾住腎蒂后迅速切除左腎上下極（切除2／3），以吸收性明膠海綿壓迫止血，復位腎臟。1周后進行第2次手術，切除右側腎臟。右腎摘除術后第2天，六味地黃湯組予以六味地黃湯灌胃（生藥含量按公式：人的劑量×0.018×5／kg體質量計算），每天1次，至處死為止；模型組、假手術組以等容積蒸餾水灌胃，給藥8周后全部處死，中途死亡的大鼠直接剔除。

1.2.2 標本收集 各組大鼠分別于灌胃第8周后處死，處死前收集24h尿量，酶聯免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測24h尿清蛋白（24urinary albumin，24hUAlb）。腹主動脈采血分離血清，酶法測定血肌酐（serum creatinine，Scr）濃度，尿素酶－GLDH 法測定血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度。腎組織分為兩部分處理：（1）光鏡觀察。標本用4%多聚甲醛固定，分別行HE染色、Masson染色及免疫組織化學檢測。（2）腎組織取出后立即放入液氮罐中，隨后轉入－80℃冰箱保存待用。

1.2.3 腎臟組織學檢查 腎組織經4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度為3～4μm）后，分別進行HE染色及Masson染色，Olympus顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 免疫組織化學染色 免疫組織化學采用兔二步法檢測試劑盒（PV－6001），一抗用兔抗大鼠抗體，一抗及工作濃度：HIF－1α（1∶100）、CTGF（1∶200），二抗用相應羊抗兔抗體，染色呈棕褐色者為陽性染色。

1.2.5 圖像分析 Olympus顯微鏡觀察腎組織病理變化并拍照，每張切片隨機選取5個視野，用麥克奧迪數碼醫學分析系統（Motic Med 6.0）進行圖像分析。測定視野內免疫陽性細胞的平均灰度值，以灰度值進行定量分析，測得組織細胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。

1.2.6 Western blot檢測 常規提取蛋白質樣品，BCA法進行蛋白質定量。每泳道50μg蛋白，10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）凝膠電泳分離后濕轉至PVDF膜，封閉，加一抗，一抗及工作濃度：HIF－1α（1∶200）、CTGF（1∶300），4℃孵育過夜。洗膜，加相應二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，ECL試劑在暗室中發光，X線膠片曝光、顯影、定影。掃描測定條帶密度值，以與β－actin的比值作為表達強度。

1.3 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎臟功能的影響 見表1。

2.2 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎組織形態學的影響HE染色下，假手術組腎小球和腎小管結構清晰，未見明顯異常；模型組腎小球系膜細胞明顯增生，硬化增多，腎小管明顯萎縮、消失，部分腎小管發生代償性擴張，可見蛋白管型，腎間質纖維化明顯，大量淋巴細胞浸潤。六味地黃湯組病變程度較模型組明顯減輕（圖1）。Masson染色下，假手術組腎小球和腎小管僅基底膜染成藍色，腎間質無明顯膠原纖維；模型組腎間質見大量染成藍色的膠原纖維；六味地黃湯組腎間質可見少量膠原纖維，膠原沉積較模型組明顯減輕（圖2）。

2.3 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎組織 HIF－1α、CTGF表達的影響

2.3.1 HIF－1α的表達 假手術組 HIF－1α微量表達，主要在腎皮髓質交界處，模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細胞、間質細胞胞質和胞核中均表達增加，腎小球表達不明顯（圖3）。

表1 3組大鼠腎臟功能檢測結果（±s）

表1 3組大鼠腎臟功能檢測結果（±s）

＊：P＜0.05，與六味地黃湯組比較。

組別 n 24hUAlb（mg）BUN（mmol／L） Scr（μmol／L）假手術組 10 3.60±1.40＊ 6.49±0.98＊ 59.60±5.82＊模型組 7 22.12±1.05＊ 13.54±1.33＊ 87.42±6.92＊六味地黃湯組9 19.08±2.02 11.66±1.20 77.44±5.68

2.3.2 CTGF的表達 假手術組CTGF表達不明顯，模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細胞、間質細胞胞質和胞核中CTGF均表達明顯增加，腎小球表達不明顯（圖4）。

2.3.3 腎組織HIF－1α、CTGF表達半定量分析 3組腎組織HIF－1α、CTGF表達在模型組最強，六味地黃湯組次之，假手術組最弱。與六味地黃湯組比較，模型組HIF－1α、CTGF的表達明顯升高（P＜0.05），見表2。

圖1 3組大鼠腎臟的病理改變（HE染色，×250）

圖2 3組大鼠腎臟的病理改變（Masson染色，×250）

圖3 3組大鼠腎組織HIF－1α的蛋白表達水平（IHC，×400）

圖4 3組大鼠腎組織CTGF的蛋白表達水平（IHC，×400）

圖5 3組大鼠腎組織HIF－1α蛋白表達電泳圖

表2 3組大鼠腎組織HIF－1α、CTGF表達的平均灰度值（±s）

表2 3組大鼠腎組織HIF－1α、CTGF表達的平均灰度值（±s）

＊：P＜0.05，與六味地黃湯組比較。

組別 n HIF－1αCTGF假手術組 10 215.30±24.60＊ 223.00±21.50＊模型組 7 141.00±12.20＊ 137.60±14.10＊六味地黃湯組9 170.70±10.90 184.20±11.40

2.4 六味地黃湯對5／6腎切除大鼠腎組織 HIF－1α、CTGF蛋白水平的影響 與六味地黃湯組比較，模型組HIF－1α、CTGF蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖5～8。

圖6 Western blot檢測3組HIF－1α的表達

圖7 3組大鼠腎組織CTGF蛋白表達電泳圖

圖8 Western blot檢測3組CTGF的表達

3 討 論

HIF－1是1992年Semenza等在低氧誘導的肝細胞癌細胞株Hep3B細胞核提取物中發現的一種蛋白質，是迄今為止發現的惟一能在缺氧狀態下發揮活性的特異性轉錄因子。已有研究表明，缺氧激活的轉錄因子HIF－1α在纖維化發展中起至關重要的作用［4］。慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是各種腎臟疾病持續進展的最終結局，其主要病理學特征為腎小球硬化和腎間質纖維化。慢性缺氧可誘發HIF－1α持續表達，后者上調一系列促纖維化靶基因導致腎間質纖維化。因此，慢性缺氧是引起腎間質纖維化的一個關鍵因素［5］，而 HIF－1α是導致腎間質纖維化的關鍵因子［6－7］。

5／6腎切除大鼠是目前研究慢性腎臟病進展的理想動物模型。已有研究表明，5／6腎切除的大鼠腎臟組織中存在小動脈病變，這種小動脈病變可導致腎小球后毛細血管血流減少和腎小管間質缺血，而缺血就意味著低氧。Manotham等［8］研究證實，在5／6腎切除大鼠模型中，在發生腎小管纖維化前，腎小管已存在明顯的缺氧。Zhang等［9］研究證實，管周毛細血管丟失和腎小管間質缺氧在腎間質纖維化不明顯之前的早期階段（術后第3周）已經很嚴重，并且持續存在于腎間質纖維化的發展過程中。Zeng等［10］研究發現，HIF－1α在5／6腎切除大鼠腎組織中顯著升高，這一結果證實慢性缺氧存在于5／6腎切除模型。俞小芳等［11］研究5／6腎切除大鼠亦發現在早期階段（術后第1周末），HIF－1α在腎內表達即開始增加，在術后12周仍有持續表達。Kimura等［6］通過應用5／6腎切除的基因敲除小鼠模型證實了HIF－1α具有促進腎纖維化的作用，認為抑制HIF－1α的表達是治療腎臟纖維化的靶點。此外，CTGF是目前公認的較強的促纖維化生長因子，其表達受 HIF－1α調控［12］。本研究顯示模型組存在明顯的纖維化，且與假手術組比較，模型組腎組織中HIF－1α、CTGF蛋白表達水平均明顯升高，說明HIF－1α可能通過調節CTGF的表達，促進腎間質纖維化。

六味地黃丸是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑［13］。其臨床療效肯定，但其作用機制缺乏深入研究。何澤云等［14］研究發現5／6腎切除大鼠在術后8周，留存腎不可避免地發生了間質纖維化。給5／6腎切除大鼠灌胃六味地黃湯8周后，其BUN、Scr的水平明顯低于模型組，并能減少留存腎系膜細胞的增生及間質纖維化，使腎切除大鼠生存期延長［15］。蔡惠芳等［16］研究發現，六味地黃丸具有改善5／6腎切除大鼠殘腎腎功能的作用，其改善殘腎腎功能的作用與六味地黃丸提高腎小球的體積密切相關。李萬斌等［17］研究認為，六味地黃丸可能通過促進MMP－2的表達，對抗Ⅳ膠原的過度沉積，減輕硬化程度，達到保護腎臟、延緩腎衰竭進程的積極作用。目前，從缺氧的角度探討六味地黃湯延緩腎間質纖維化的機制研究尚未見報道，缺氧是導致腎間質纖維化的重要原因，而六味地黃湯具有耐缺氧、抗氧化的作用，為本研究提供了堅實的理論依據。本研究結果顯示，與模型組比較，六味地黃湯組HIF－1α、CTGF蛋白表達水平均明顯降低，提示六味地黃湯延緩腎間質纖維化的作用機制可能是通過改善缺氧從而抑制HIF－1α的表達，進而下調CTGF的蛋白水平，從而減輕腎間質纖維化。

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