補(bǔ)腎調(diào)肝方抗卵巢衰老的作用機(jī)制的研究

陳玉梅 余志惠 黃桂花 沈維增 鐘琳 姜煥好

圍絕經(jīng)期綜合征是基于卵巢衰老而引發(fā)的一系列生理、心理病理性改變，臨床以情緒調(diào)節(jié)障礙及生理機(jī)能漸行性衰退為主要表現(xiàn)［1］。中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏精，主生殖”，腎陽(yáng)充盛為女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代研究表明，卵巢衰老是一個(gè)多重環(huán)節(jié)參與的漸進(jìn)過(guò)程，受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的雙重調(diào)節(jié)。卵巢萎縮，雌二醇(estradiol，E2)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、孕酮(pregnendione，P)等雌激素分泌減少是卵巢衰老的早期信號(hào)［2，3］;同時(shí)，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)廣泛性激活，導(dǎo)致卵泡閉鎖。本研究以“卵巢顆粒細(xì)胞及其細(xì)胞因子的變化規(guī)律”為主線(xiàn)，觀察補(bǔ)腎調(diào)肝類(lèi)方藥對(duì)卵巢衰老的調(diào)節(jié)作用，以期為其抗卵巢衰老機(jī)制的完善提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物和分組 本實(shí)驗(yàn)納入3、6、12、18、24月齡健康Wistar大鼠共計(jì)120只，以其月齡為分組標(biāo)準(zhǔn)，分為5組，每組24只;在此標(biāo)準(zhǔn)下，各組大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和干預(yù)組各12只，共計(jì)10組。

1.2 儀器和器材 切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，LeicaRM2135);電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，SY11 Wi);光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus公司，BX43);低溫超速離心機(jī)(Beckman，AJ-30I);Mastercycler pro梯度PCR儀(eppendorf，Mastercycler pro);微量電動(dòng)組織勻裝器(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司);核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf公司，Biophotometerplus);凝膠成像分析儀(上海復(fù)日科技有限公司，F(xiàn)R-980)等。

1.3 主要試劑 TUNEL試劑盒(天津顴洋生物技術(shù)有限公司);總RNA提取試劑盒提取試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，NEP019-1);Oligod(T)1 8 primers(TaKaRa公司，D511);M-MLV RT(Promega公司，M1701);Ribonuclease Inhibitor(TaKaRa公司，D2313A);10 mmol dNTP Mixture(TaKaRa公司，D4030RA);2.5 mmol dNTP Mixture(TaKaRa公司，D4030A);rTaq(含 6Xloading buffer、10XPCRbuffer)(TaKaRa公司，DRIOOA);DL2000 marker(TaKaRa公司，D501A);DEPC(Sigma公司);瓊脂糖(BIOWEST，91622);DNAgreenMarker(北京天恩澤，70303);其他常用試劑如氯仿、無(wú)水乙醇、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 研究方法

1.4.1 給藥及取材方法 干預(yù)組以補(bǔ)腎調(diào)肝方灌胃干預(yù)20 ml/(kg·d)，對(duì)照組灌以同等劑量的無(wú)菌飲用水;干預(yù)15 d，處死取卵巢;各組均選取6例樣品浸入4%多聚甲醛液固定，行TUNEL染色;剩余 6例余-70℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，行RT-RCR。

1.4.2 TUNEL染色和凋亡指數(shù)(AI)計(jì)算方法 TUNEL染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)流程進(jìn)行，封片后以電鏡觀察卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)。高倍視野下棕黃色顆粒即為卵巢顆粒細(xì)胞，采用Metamorph圖像分析系統(tǒng)分析圖像;隨機(jī)選取5～7個(gè)視野，以凋亡顆粒細(xì)胞占顆粒細(xì)胞總數(shù)的百分比為AI。

1.4.3 RT-PCR方法 以總RNA提取試劑盒提取卵巢組織mRNA，在Mastercycler pro梯度PCR儀中自動(dòng)完成常規(guī)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程;所得產(chǎn)物以核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度，作為模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增。各基因引物序列見(jiàn)表1。

擴(kuò)增后所得產(chǎn)物為目的mRNA，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含 DNA Green 4 μl/100 ml)電泳，穩(wěn)壓100 V，電泳30-40 min，凝膠成像分析儀觀察，計(jì)算相對(duì)光度值。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 AI 對(duì)照組3、6、12月齡大鼠的AI均處于較低，18、24月齡大鼠AI均顯著升高(P＜0.05);與對(duì)照組相比，研究組大鼠各月齡AI均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 Bax 對(duì)照組3、6、12月齡大鼠的Bax mRNA表達(dá)處于較低水平，18、24月齡顯著升高(P＜0.05);與對(duì)照組相比，干預(yù)組各月齡大鼠Bax mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 Bcl-2 對(duì)照組3、6、12月齡大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)處于較高水平，18、24月齡顯著降低(P＜0.05);與對(duì)照組相比，干預(yù)組各月齡大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表2 各組大鼠AI比較(x ± s，%)

表3 各組大鼠Bax mRNA表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠Bax mRNA表達(dá)比較(±s)

組別 3個(gè)月 6個(gè)月 12個(gè)月 18個(gè)月 24個(gè)月對(duì)照組 0.321±0.022 0.337±0.018 0.341±0.016 0.884±0.092 0.741±0.063干預(yù)組 0.201±0.017* 0.221±0.019* 0.224±0.015* 0.451±0.055▲ 0.446±0.027＊▲

表4 各組大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)比較(±s)

表4 各組大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)比較(±s)

組別 3個(gè)月 6個(gè)月 12個(gè)月 18個(gè)月 24個(gè)月對(duì)照組 0.612±0.021 0.622±0.032 0.635±0.031 0.224±0.021 0.239±0.015干預(yù)組 0.826±0.033* 0.794±0.035* 0.815±0.034* 0.514±0.049▲ 0.507±0.041＊▲

3 討論

圍絕經(jīng)期綜合征以情志障礙和內(nèi)分泌紊亂為臨床兩大病理表現(xiàn)，其主要始動(dòng)因素為卵巢衰退、雌激素水平低下所致卵泡閉鎖。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞、及內(nèi)膜細(xì)胞共同構(gòu)成卵泡的體細(xì)胞。研究表明，顆粒細(xì)胞主司卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)，在卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和增殖過(guò)程中具有的調(diào)控重要作用;同時(shí)，也是促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的主要物質(zhì)，其凋亡指數(shù)AI可間接衡量卵泡的發(fā)育狀態(tài)。Bax與Bcl-2是近年研究較為廣泛的兩類(lèi)凋亡因子［4］，廣泛存在于胚胎、淋巴、及部分腫瘤組織中。其中Bax可促進(jìn)凋亡信號(hào)的過(guò)表達(dá)，因而又稱(chēng)促凋亡因子;而B(niǎo)cl-2基于己身對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的顯著抑制效應(yīng)，又稱(chēng)為凋亡抑制因子。

本課題組補(bǔ)腎調(diào)肝方是以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合臨床實(shí)踐而研制的經(jīng)驗(yàn)方。方中合用菟絲子、川斷、蛤蚧以滋陰、溫腎、助陽(yáng)，可穩(wěn)內(nèi)分泌;合用白芍、遠(yuǎn)志以柔肝、寧心可平情志。本研究從現(xiàn)代生物分子學(xué)水平上表明，Bcl-2 mRNA低表達(dá)及Bax mRNA高表達(dá)啟動(dòng)顆粒細(xì)胞的調(diào)亡過(guò)程可能為卵巢衰老的重要機(jī)制之一;而補(bǔ)腎調(diào)肝方藥可顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，延緩顆粒細(xì)胞的調(diào)亡過(guò)程，推測(cè)可能為其抗卵巢衰老的作用機(jī)制之一。

［1］ Zhou B，Sun X，Zhang M，et al.The symptomatology of climacteric syndrome:whether associated with the physical factors or psychological disorder in perimenopausal/postmenopausal patients with anxiety-depression disorder．Arch Gynecol Obstet，2012，285(5):1345-1352．

［2］ Studd JW.A guide to the treatment of depression in women by estrogens．Climacteric，2011，14(6):637-642．

［3］ Graziottin A.Safety，efficacy and patient acceptability of the combined estrogen and progestin transdermal contraceptive patch:a review．Patient Prefer Adherence，2008，2(2):357-367．

［4］ 梁欣韞，牛建昭，楊美娟.育泡飲對(duì)自身免疫性POF小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，v.3101:21-23．