馬拉色菌培養(yǎng)基的改良及應用

穰 真，崔 凡，李 薇，王有為

(1.四川大學華西醫(yī)院皮膚性病科，四川 成都 610041;2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610031)

目前已知的11種馬拉色菌中，除厚皮馬拉色菌外，都屬于嗜脂性酵母[1]。Benham于1939年首次發(fā)現馬拉色菌的生長依賴于培養(yǎng)基中含有的脂類物質[2]。由此，一系列的馬拉色菌培養(yǎng)基應運而生，使得馬拉色菌的培養(yǎng)和鑒定不再困難。在此基礎上關于馬拉色菌的致病機制和分型方面的研究得以順利開展。目前比較常用的馬拉色菌培養(yǎng)基有兩種，分別為 Leeming＆Notman 培養(yǎng)基[3]和 Dixon 培養(yǎng)基[4]。由于馬拉色菌胞壁富含脂類而韌性高，為破壁提取DNA增加了難度。因此，為了保證所提取DNA的數量和質量，實驗所用菌量非常重要。目前馬拉色菌在傳統(tǒng)Leeming＆Notman培養(yǎng)基以及Dixon培養(yǎng)基上的生長條件為35℃，7天。本研究利用馬拉色菌對于脂質的依賴性，通過改變Leeming＆Notman培養(yǎng)基中橄欖油和吐溫60的含量，摸索出能顯著提高馬拉色菌培養(yǎng)菌產量的方案，并驗證。

1 材料與方法

1.1 馬拉色菌培養(yǎng) 傳統(tǒng)的Leeming＆Notman培養(yǎng)基配方為：1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛膽鹽、0.1%甘油、0.05%單硬脂酸甘油酯、0.05%吐溫60、1%全脂奶、2%橄欖油、1.2%瓊脂、0.5%放線菌酮、0.05%氯霉素。本研究共設3組，每組設 3個樣本：第 1組含 1%橄欖油和0.025%吐溫60，其余成分含量不變;第2組含2%橄欖油和0.05%吐溫60，即標準的Leeming＆Notman培養(yǎng)基;第3組含4%橄欖油和0.1%吐溫60。制備上述3種培養(yǎng)基各10ml，倒入小平皿內。取一環(huán)球形馬拉色菌在1ml滅菌蒸餾水中研磨均勻，用移液器各取5μl含菌懸液滴加入培養(yǎng)基中央，置恒溫箱35℃保存。自培養(yǎng)第3、5、7天，每天測量菌落直徑并拍照。

1.2 馬拉色菌DNA提取及含量分析 在培養(yǎng)第7天，刮取各菌落，用CTAB法提取馬拉色菌基因組DNA[5]。將DNA 溶解于50μl純凈水，吸取 10 μl DNA溶液，轉移至990μl純凈水，于分光光度計下讀取260nm波段的OD值。DNA濃度(mg/m l)=50×(260 nm的OD值)×稀釋倍數(本實驗為100)。

1.3 擴增馬拉色菌ITS1-2區(qū) 參照文獻[6]設計真菌ITS1和ITS2引物(由上海生物工程有限公司合成)，擴增馬拉色菌基因組ITS1-2區(qū)。反應體系為 DNA 1 μl、10×buffer 5 μl、Mgcl2(25 mmol/L)3 μl、dNTP(10 mmol/L)1 μl、引物(10μmol/L)各 1 μl、Taq DNA 聚合酶(BBI)2.5 U，用去離子水補足至50μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，連續(xù)35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。得到的PCR產物于120 V泳動20分鐘，經EB染色后凝膠呈像。

1.4 統(tǒng)計學方法 所得數據以均數±標準差表示，使用SPSS 11.0軟件進行組間差異性比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

培養(yǎng)第3日，4%橄欖油組馬拉色菌在Leeming＆Notman培養(yǎng)基上的生長速度和2%橄欖油組差異無統(tǒng)計學意義[(5.83±0.76)mm vs(4.83±0.29)mm，P=0.101]，但在后者的生長速度明顯超過1%橄欖油組[(4.83±0.29)mm vs(2.67±0.58)mm，P=0.004]。培養(yǎng)第5日，4%橄欖油組的生長速度顯著快于2%橄欖油組[(7.33±0.29)mm vs(6.17±0.29)mm，P=0.008]。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組之間的差異進一步擴大。第7日，4%橄欖油組的馬拉色菌無論是生長速度還是菌落直徑都高于另兩組(圖1)，證明橄欖油含量的增加對馬拉色菌的生長有顯著促進作用。在培養(yǎng)第7天，生長于含4%橄欖油Leeming＆Notman培養(yǎng)基的馬拉色菌DNA濃度顯著高于2%橄欖油組[(273.33±24.66)mg/ml vs(205.67±13.32)mg/ml，P=0.014]，而后者亦高于1%橄欖油組[(205.67±13.32)mg/ml vs(118.33±15)mg/ml，P=0.002]，見圖 2。該結果提示改良的Leeming＆Notman培養(yǎng)基增加培養(yǎng)菌量，從而直接提高DNA的產出。擴增不同組馬拉色菌DNA的ITS1-2區(qū)，電泳后可見長度約280 bp片段，同時4%橄欖油組PCR產物的熒光強度明顯高于2%橄欖油組和1%橄欖油組(圖3)。該結果提示由于含4%橄欖油的培養(yǎng)基增加了馬拉色菌DNA產量，其PCR產物的產量也得到相應提高。

圖1 球形馬拉色菌在含不同濃度橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基上的生長狀況 a：培養(yǎng)第3、5、7日的菌落形態(tài);b：培養(yǎng)第3、5、7日的菌落直徑

圖2 球形馬拉色菌在含不同濃度橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基上的DNA產量

圖3 球形馬拉色菌ITS1-2區(qū)電泳結果1：DNA marker;2：陰性對照;3：1%橄欖油組;4：2%橄欖油組;5：4%橄欖油組

3 討論

馬拉色菌是一種嗜脂性的真菌，其生長速度與所處環(huán)境的含脂量成正比。這一點也在與馬拉色菌相關的疾病中得到證實。馬拉色菌所引起的疾病通常好發(fā)于皮脂豐富的區(qū)域，因為這些區(qū)域為馬拉色菌的生長提供了必需的脂源[7]。

本研究針對Leeming＆Notman培養(yǎng)基的橄欖油含量設立了3組含有不同脂質比例的培養(yǎng)基，動態(tài)觀察了菌落的生長狀況。實驗結果表明4%橄欖油對馬拉色菌生長的促進作用是顯而易見的。無論是馬拉色菌的生長速度還是最終菌落直徑都較標準的含2%橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基組和1%橄欖油組高。DNA定量檢測證實在相同培養(yǎng)時間內，獲得菌量越大，提取的基因組DNA也越多。當前的醫(yī)學真菌學研究更多地使用各種分子生物學技術對真菌的功能性基因及其編碼的生物活性蛋白進行分析。真菌種屬的分型鑒定研究也離不開相應的分子生物學技術。因此提供足量、優(yōu)質的真菌基因組DNA是這些研究的前提。我們擴增了馬拉色菌ITS1-2區(qū)，進一步證實更多的DNA產出保證了PCR產物的質量。改良的含4%橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基有利于提高馬拉色菌科研工作的效率。

本研究的創(chuàng)新之處在于通過將Leeming＆Notman培養(yǎng)基中橄欖油含量增加到4%，加速了馬拉色菌的生長速度，縮短了培養(yǎng)周期。我們在增加橄欖油含量的同時，也相應增加吐溫60的含量。吐溫60是一種乳化劑。增加吐溫60的目的是使得培養(yǎng)基中的油相和水相更好的交融，避免出現油含量增多導致的油水分層。而吐溫60對球形馬拉色菌的生長沒有促進作用[8]，所以可以確定馬拉色菌的快速生長完全是橄欖油作用的結果。我們也嘗試進一步增加橄欖油含量，結果會出現培養(yǎng)基的油相和水相分層，而且馬拉色菌生長增快不明顯，最重要的是過多的油介入會影響DNA的提取質量。所以經改良含4%橄欖油和0.1%吐溫60的Leeming＆Notman培養(yǎng)基是保證馬拉色菌生長數量和質量的最佳平衡點。

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