HPLC法測定患者血漿中甲氨蝶呤的濃度

李文艷 彭梅

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種二氫葉酸還原酶抑制劑，目前廣泛用于治療兒童淋巴性白血病、淋巴瘤和骨肉瘤等惡性腫瘤。甲氨蝶呤的體內藥代動力學參數個體差異大，毒性大，監測其血藥濃度有重要意義，為臨床安全用藥提供指導。目前測定甲氨蝶呤的方法主要有微生物法、熒光偏振免疫法、高效液相色譜法。筆者根據南昌市第一醫院藥劑科現有試驗條件，建立高效液相色譜法測定血漿中甲氨蝶呤濃度，現報告如下。

1 儀器與試藥

Agilent HPLC 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；；OpenLAB CDS ChemStation 化學工作站；Mettler-Toledo(FE20)pH計；TGL-16G高速離心機(上海)；甲氨蝶呤對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100138-201104)；甲醇為色譜純；高氯酸、醋酸為分析純；水為重蒸水。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)流動相：醋酸(pH=2.86)-甲醇(82.5：17.5)；流速：0.8 ml/min；柱溫：40℃；檢測波長 306nm。

2.2 對照品的配制 精密稱了MTX對照品50.10 mg置50 ml溶量瓶中加磷酸緩沖鹽定容至刻度，得1020μg/ml的對照儲存液，置于4℃冰箱保存。使用時精密吸取適量對照液配制成所需濃度。

2.3 血漿樣品的預處理 取血漿樣品1 ml，分別置于5 ml離心管中，加入160 μl濃度為20%高氯酸液，沉淀血漿中的蛋白質，渦懸混勻1 min，高速度離心(10000 r/min)5 min．。取上清液0.6 ml置于2 ml離心管中，加入20 μl濃度為0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，渦懸混勻1 min，取30 μl進樣，按外標法以峰面積計算樣品含量。

2.4 專屬性考察 在本實驗條件下空白血清，MTX標準品血清樣品，經高效液相色譜法測定，得到的色譜圖，峰形尖銳且分離良好(R＞1.5)，血清中內源性成分對其測定均無干擾。MTX的保留時間為：10.18 min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 血漿樣品色譜圖

2.5 線性關系考察 將對照液儲存液用血漿按梯度稀釋成10.20μg/ml，3.06μg/ml，1.02μg/ml，0.306μg/ml，0.102μg/ml，0.03μg/ml的標準血漿溶液，按“2.3”項處理，“2.1”項色譜條件測定峰面積。以MTX溶液的嘗試對峰面積作線性回歸(n=5)得回歸方程：y=0.0146x+0.0004(濃度：0.03～1020μg/ml)，r=1。最低檢測限 0.03μg/ml(S/N=3)，最低定量限：0.306μg/ml(S/N=10)

結果表明MTX在0.03～10.20μg/ml有良好的性線關系。最低檢測限 0.03μg/ml(S/N=3)，最低定量限：0.306μg/ml(S/N=10)。

2.6 精密度試驗 配制高中低不同濃度(0.306μg/ml，1.02μg/ml，3.06μg/ml)MTX 血漿各 3 份。按“2.3”項平行操作，得日內相對標準差(RSD)，連續測定3 d得平均日間相對標準差(RSD)(見表1)。高、中、低濃度的平均日內日間RSD均＜有5%。

2.7 回收率實驗 取“2.6”項下3種濃度的標準血樣各3份，按“2.3”項方法處理后進樣分析，記錄樣品峰面積A1，用標準曲線計算出樣品濃度，與加入的實際濃度比較，得本方法的回收率；同時取與各濃度標準血樣相同標示量的水溶液直接進樣，記錄MTX峰面積A2，計算各濃度樣品提取回收率：提取回收率=A1/A2×100%，結果見表1。

表1 MTX的日內、日間變異和回收率實驗

3 討論

本文參考有關文獻在樣品的處理和流動相的選擇上進行優化［1-5］，選用高氯酸做蛋白沉淀劑，為提高回收率將其濃度提高到20%；在上清液中加入氫氧化鈉調節pH值［3-4］保護色譜儀。有文獻報道血清經高氯酸處理后，在MTX附近會出現雜峰，且無法與目標峰分離，建議在樣本經處理后須在30 min內上機檢測［1］，但本試驗方法處理后的血漿樣品性質穩定，并未影響實驗結果。實驗過程中發現藥品用色譜柱Agilent ZorbaxSB-C18柱分離時峰形嚴重拖尾，換用不同流動相并不能改善拖尾現象，而改用Agilent Eclipse XDB-C18柱后峰形尖銳、無拖尾峰存在，流動相不用緩沖鹽也能得到較好峰形。

本試驗建立的HPLC法檢測限低、保留時間適宜、線性范圍廣，重現性好。用于測定血漿中甲氨蝶呤的質量濃度，所需樣本量少，色譜條件穩定，操作簡單，成本低廉，可用于臨床血藥濃度監測和藥物動力學的研究。

［1］ 許耕川，袁向亮，沈立松，等．HPLC法測定血清甲氨蝶呤濃度的方法建立及其與熒光偏振法的比較．檢驗醫學，2010，25(9)：701-704.

［2］ 李惠芬，許俐．高效液相色譜法測定甲氨蝶呤血藥濃度．天津醫藥，2003，31(7)：446-447.

［3］ 李碧峰，馮惠平，賈晉蓉，等．反相高效液相色譜法測定血漿中甲氨蝶呤的質量濃度．中國農業，2010，19(19)：7-8.

［4］ 唐麗紅．HPLC法測定宮外孕患者血清中甲氨蝶呤的濃度．海峽藥學．2003，1(1)：101-103.

［5］ 王印．治療藥物監測．北京：人民軍醫出版社，2011：220-224.