青頭菌的分離純化及ITS序列鑒定*

馬紅英，楊明摯，張漢波，喬云倩，沙 濤＊＊

(1.云南大學生物資源保護與利用國家重點實驗室培育基地，云南 昆明 650091;2.云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091)

青頭菌又名綠菇 (Russula virescens)，隸屬于紅菇科(Russulacese)、紅菇屬 (Russula)，子實體大，食味鮮美，營養豐富，是常見菌類中最受人們歡迎的食用菌之一［1］。青頭菌是外生菌根真菌，與闊葉樹種及針葉樹種如云南松等形成外生菌根［2］。青頭菌中各種礦物元素和人體必需氨基酸的含量為0.58%，氨基酸總量為1.39%，必需氨基酸占總氨基酸的比值 (EAA/TAA)為41.8%，硒為每100克1.3 mg［3］。青頭菌子實體中所含的4種多糖為雜多塘，含有的單糖組分分別為木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖，其中葡萄糖為主要單糖組分［4］。Zhong－wei Sun等報道青頭菌中含有可溶性粗多糖命名為RVP－1和RVP－2，其中RPV－1為較好的抗氧化劑［5］。

目前，青頭菌的研究報道不多，國內主要集中在保鮮和化學成分分析方面。趙天瑞等［6］對青頭菌凍結工藝進行了研究，湯建國等報道變綠紅菇化學成分研究分析結果［7］，孫忠偉等報道變綠紅菇子實體多糖的理化性質及其抗腫瘤活性研究［4］，徐丹先等報道云南野生青頭菌的化學成分分析結果［3］。國外對青頭菌的報道主要集中于系統發育方面，澳大利亞Lebel和Tonkin報道經ITS鑒定的紅菇科系統發育結果［8］。歐洲Miller和Buyck對紅菇屬以下的種進行了分子系統發育分析，報道青頭菌與Russula mustelina親緣關系較近［9］。Shimon等通過對rDNA大亞基鑒定，紅菇科系統發育分析結果顯示，青頭菌與紅菇屬Russula viridirubrobimbata親緣關系較近［10］。目前，人工馴化方面還未取得實質性進展，雖有報道青頭菌的菌絲體分離研究，但未見對其得到的菌絲體進行鑒定。

對于食用菌的人工馴化，首先需要解決食用菌的菌種分離問題。食用菌菌種分離方法主要有孢子分離法、組織分離法和基內菌絲分離法3種。其中組織分離法無菌操作技術要求較其他方法簡便，因此組織分離法在實踐中被廣泛地應用［11］。分離菌絲體的鑒定是后續研究的基礎，其中ITS(Internal Transcribed Spacer)是核糖體DNA中的非編碼轉錄間隔區，目前被廣泛應用于不同物種的系統發育、進化和分類研究及菌種鑒定［12］，是真菌條形碼之一，在外生菌根真菌分離物的鑒定中也得到廣泛運用。

本研究采用組織分離法對菌柄及菌蓋進行分離，對ITS序列進行鑒定。

1 材料及方法

1.1 供試菌種

青頭菌子實體，采于彌勒縣，編號為ML4。

1.2 培養基

PDA培養基;MMN改良培養基:馬鈴薯200 g(去皮，切片，煮沸20 min，用4層紗布過濾，取濾液)、葡萄糖5 g、麥芽糖2 g、酵母粉1 g、酒石酸銨0.25 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.15 g、氯化鈣 (1%)5 mL、氯化鈉 (1%)2.5 mL、氯化鐵 (1%)1.2 mL、瓊脂16 g，pH 5.5，蒸餾水1 000 mL;改良培養基:KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、麥芽糖5 g、酒石酸銨2 g、VB11 mL(40 μg·L－1)、瓊脂粉20 g，pH 6.0，水 1 000 mL。

3 方法

3.1 菌絲體的分離、純化

采用組織分離法，將預先配好的以上3培養基切成大小2 cm×2 cm的小塊，分裝于各平板中，每平板5塊，盡量留足夠的間隙。之后于無菌條件下用鑷子取已經用酒消毒的新鮮子實體菌柄、菌蓋部位的組織，置于母種培養基上，25℃恒溫培養。每處理5次重復，一級母種滿管后轉管2次。觀察菌絲的生長速度及菌落形成情況。

3.2 DNA的提取、擴增及鑒定

采用CTAB真菌DNA提取法［13］，將挑取的菌絲置于經滅菌的1.5 mL干燥離心管，加入400 mL CTAB提取液，進行研磨，研磨充分后加入200 mL CTAB提取液，65℃水浴1 h，再加入600 mL氯仿－三氯甲烷混合液，混合均勻后13 000 r·min－1離心10 min，收集上清液于新的1.5 mL離心管，之后重復以上操作2遍～3遍，直至上清液干凈。之后用等體積的三氯甲烷抽提，然后在抽提所得的上清液中加入0.5倍～1倍體積的異丙醇，4℃、13 000 r·min－1離心10 min。離心完畢后，棄上清液，將離心管倒扣于干凈的濾紙上直至吸光管上液體，之后用75%乙醇洗滌并離心2遍，倒扣于濾紙一夜，第2天加入40 μL去離子水。

采用通用引物 ITS4和 ITS5(ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)， 對 其ITS rRNA基因進行擴增［12］。擴增體系總體積為50 μL，其中41.35 μL 去離子水，10 × PCR Buffer 5 μL，10 mmol·L－1dNTP 1 μL，10 μmol·L－1ITS4/ITS5 引物各0.6 μL，TaqDNA 酶0.25 μL，模板 DNA 1 μL(濃度 20 ng·μL－1～50 ng·μL－1)。PCR反應條件:94℃反應1 min，94℃反應15 s，61℃反應15 s，72℃反應1 min，30個循環，72℃反應5 min。

測序反應體系為:kit酶 2 μL，0.5 μmol·L－1ITS4/ITS5引物3 μL，PCR反應產物1 μL。測序反應條件為96℃反應10 s，50℃反應5 s，60℃反應4 min，25個循環。

測序結果通過DNAStar、Chromas軟件校對，并在NCBI中BLAST比對下載已發表的＞96%的相似序列，相關序列用MEGA 4軟件經CLUSTALW比對，剪切136 bp～834 bp位點序列，采用Jukes－Cantor模型構建N－J樹。

2 結果

2.1 分菌統計結果

分別對5塊菌蓋及菌柄進行分離，結果見表1。

表1 各培養基及各分離部位分離統計

從表1可以看出，PDA培養基分離成功數均為0，MMN改良培養基成功數為菌蓋成功數3，菌柄成功數4，改良培養基成功數分別為菌蓋成功數3，菌柄成功數4，因此MMN改良培養基為最佳培養基。

2.2 形態觀察結果

分離物在25℃下培養50 d，形態觀察結果見圖1。

從圖1可以看出，菌落呈乳白色，圓形，菌絲致密，氣生菌絲不發達。

3 系統發育樹結果

系統發育樹結果見圖2。

從圖2可以看出，青頭菌的多樣性較豐富，種內差異較大。而本研究所分離的菌株ML4不與其他序列形成1支，遺傳差異較大。

4 討論

由于青頭菌是營養共生型的外生菌根菌，必須供給其合適的營養成分和生長條件才能使其孢子萌發、菌絲生長。在培養中菌絲生長較慢且極易被污染，因此在分離過程中要嚴格地進行消毒和無菌操作。本研究發現作為真菌分離常用的培養基PDA不能作為青頭菌分離的培養基，選用改良MMN培養基，對菌柄進行分離為最佳分離方案，分離成功率達到80%，因此改良MMN培養基為菌種分離最佳培養基。本實驗研究中由于青頭菌菌種菌絲生長較慢，生長2個月達到5 cm左右便停止生長，因此要達到人工馴化的目的，還需進行進一步的優化培養研究，尋找營養足夠適合該菌種生長的培養基。

外生菌根分離物是食用菌人工馴化的基礎，因此必須對菌種進行科學鑒定。目前菌種鑒定，遺傳多樣性研究主要基于形態學水平、細胞水平、生化水平及分子水平得以開展［14］。而DNA作為遺傳物質能客觀和真實地反映物種之間的親緣關系，對于菌種鑒定和系統分類是一種更有力的依據和補充。對比分離物及對應子實體DNA指紋并結合分離菌株的形態特征來鑒別菌株是否屬于目的菌種的方法更趨科學和完善。因此，建議以后的研究利用分子方法對分離物進行鑒定。

本研究還發現，本實驗所分離到菌種與其它地區的青頭菌有較大的遺傳差異性，而且青頭菌的種內差異較大，生物多樣性較為豐富，而云南野生食用菌資源較為豐富，青頭菌分布較為廣泛。因此，下一步進行云南野生青頭菌的系統發育研究是必要的。

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