“長林”系列油茶籽中非油類主要功能性成分比較

李海琳 劉京晶 斯金平 吳令上 馮 瓅 楊曉梅

(浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地天然藥物研發中心，臨安 311300)

油茶(Camellia oleifera Abel.)為我國特有的木本油料樹種，具有很高的食藥用價值。茶籽油富含不飽和脂肪酸，營養價值高，有“東方橄欖油”之稱［1］。此外，油茶籽榨油后的餅粕中含有豐富的三萜皂苷、黃酮、多糖和蛋白質等功能性成分，極具開發利用前景:皂苷具有抗炎、抗過敏、抗肝毒、降血壓等藥用價值［2］;黃酮類化合物具有抗氧化、抗心腦血管疾病等多種生理功能［3］;茶籽多糖具有抗血栓、降血糖、修復糖代謝紊亂、調節免疫以及抗氧化等活性［4－5］;茶籽蛋白中含有17種氨基酸，其中8種是人體必需的氨基酸［6－7］，可以作為生產蛋白飲料、焙烤食品等的蛋白質強化劑，經酶解還可制備功能性多肽［8］。目前，油茶產區正在大規模推廣種植“長林”系列油茶新品種，本研究主要通過對“長林”系列10個品種油茶籽種仁中總三萜、總黃酮、總多糖和總蛋白4種非油類功能性成分的含量進行測定和分析，為油茶籽的綜合利用、油茶新品種選育以及相關功能性食品或藥品的開發提供科學依據。

1 材料

1.1 試劑與儀器

蘆丁、D－葡萄糖、齊墩果酸、牛血清蛋白對照品:中國藥品生物制品檢定所;Lowry法蛋白含量測定試劑盒:上海荔達生物技術有限公司;香蘭素:天津市永大化學試劑有限公司;苯酚:北京索萊寶科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁:上海振欣試劑廠;氫氧化鈉:西隴化工股份有限公司;冰乙酸、無水乙醇、濃硫酸均為分析純:天津市永大化學試劑有限公司。

UV 2500紫外－可見分光光度計:上海第三分析儀器廠;DK－S24型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實驗儀器有限公司;AB104－N電子分析天平:梅特勒托利多儀器上海有限公司;SWB5200型超聲波清洗儀:上海必能信超聲有限公司;D－37520型高速離心機:德國HERAEUS公司;RE－121旋轉蒸發儀:瑞士步琪公司。

1.2 供試樣品

“長林”系列10個品種油茶種籽均于2011年10月份采自浙江省麗水市油茶種質資源庫，剝除果皮和種殼，種仁于60℃干燥箱中烘干，粉碎過10目篩，干燥器中保存。除長林180號外，其余均已通過國家或省級良種審定［9］(表1)。

2 方法

2.1 總三萜的含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備

取油茶籽種仁粉末 0.5 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入甲醇25 mL，80℃水浴回流提取1 h，過濾、將濾液定容至250 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品2 mg，置于10 mL容量瓶內，加入甲醇定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的對照品溶液，置冰箱中備用。

表1 “長林”系列油茶品種基本情況

2.1.3 標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL分別至試管中，加甲醇補足至1 mL，100℃水浴蒸干后，分別加入5%香草醛 －冰醋酸溶液0.5 mL，搖勻，加入高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴20 min，取出后于冰水浴中加入冰乙酸5 mL，搖勻，室溫放置15 min。以甲醇溶液為空白對照，同法操作，在550 nm波長處測定吸光度值。以濃度(x)為橫坐標，吸光度值(y)為縱坐標繪制標準曲線，結果總三萜的標準曲線方程為 y=7.587 5x －0.002 8，r=0.999 2(n=5)，線性范圍為0.02 ～0.16 mg。

2.1.4 顯色穩定性試驗

取同一供試品溶液，按2.1.3操作，每隔0.5 h測定其吸光度值，結果RSD為2.62%(n=5)，表明供試品溶液在顯色后2 h內穩定。

2.1.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液6份，各1 mL，按2.1.3連續測定，結果RSD為1.62%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗

按2.1.1平行制備6份供試品溶液，分別測定其吸光度值，結果RSD為4.38%，表明方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一供試品6份各0.25 g，分別加入適量齊墩果酸對照品溶液，按2.1.1制成供試品溶液，按2.1.3測定吸光度值，計算回收率為99.3% ～104.1%，RSD 為1.63%。

2.1.8 樣品含量測定

樣品按2.1.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取1 mL至試管中，按2.1.3測定吸光度值，計算其含量。

2.2 總黃酮的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備

取油茶籽種仁粉末1.0 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入80%甲醇50 mL，80℃水浴回流提取1 h，過濾、將濾液濃縮后定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品11.1 mg置于50 mL容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，配制成0.222 mg/mL的對照品溶液，置冰箱中備用。

2.2.3 標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min;加1%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min;加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，再加80%甲醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以80%甲醇溶液為空白對照，同法操作，在510 nm波長處測定吸光度值［3］。以濃度(x)為橫坐標，吸光度值(y)為縱坐標繪制標準曲線，結果總黃酮的標準曲線方程為 y=0.452 12x+0.000 59，r=0.999 9(n=6)，線性范圍為0.222 ～2.22 mg。

2.2.4 顯色穩定性試驗

取同一供試品溶液，按2.2.3操作，每隔0.5 h測定其吸光值，結果RSD為2.13%(n=5)，表明供試品溶液在顯色后2 h內穩定。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液6份，各2 mL，按2.2.3連續測定，結果RSD為2.01%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗

按2.2.1平行制備6份供試品溶液，測定其吸光度值，結果RSD為3.13%，表明方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一供試品6份各0.5 g，分別加入適量蘆丁對照品溶液，按2.2.1制成供試品溶液，按 2.2.3測定吸光度值，計算回收率為97.9% ～101.2%，RSD 為1.69%。

2.2.8 樣品含量測定

樣品按2.2.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取1 mL至25 mL容量瓶中，按2.2.3測定吸光度值，計算其含量。

2.3 總多糖含量的測定

2.3.1 供試品溶液的制備

取油茶籽種仁粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入石油醚100 mL，密塞超聲脫脂30 min。過濾，揮干溶媒，加入80%無水乙醇100 mL，轉移至圓底燒瓶中，85℃回流提取1 h，趁熱過濾，揮干溶媒，加入蒸餾水100 mL，100℃回流提取2 h，趁熱過濾，定容至250 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的D－無水葡糖糖對照品10.0 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配制成0.1 mg/mL的對照品溶液，置冰箱中備用。

2.3.3 標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液 0.1、0.3、0.6、0.9、1.5、1.8 mL分別至試管中，加蒸餾水補足至2 mL，搖勻后冰浴中加入5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸溶液5 mL，同時搖勻，靜置5 min，100℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫。以蒸餾水為空白對照，同法操作，在490 nm波長處測定其吸光值［10］。以濃度(x)為橫坐標，吸光度值(y)為縱坐標繪制標準曲線，結果總多糖的標準曲線方程為 y=13.937x －0.043 9，r=0.999 7(n=6)，線性范圍為0.01 ～0.18 mg。

2.3.4 顯色穩定性試驗

取同一供試品溶液，按2.3.3操作，每隔0.5 h測定其吸光度值，結果RSD為2.03%(n=5)，表明供試品溶液在顯色后2 h內穩定。

2.3.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液6份，各0.9 mL，加蒸餾水補足至 2 mL，按 2.3.3連續測定，結果 RSD 為2.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗

按2.3.1平行制備6份供試品溶液，測定其吸光度值，結果RSD為1.54%，表明試驗重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一供試品6份，各0.25 g，分別加入適量葡萄糖對照品溶液，按2.3.1制成供試品溶液，按2.3.3測定吸光度值，計算回收率為96.5% ～101.7%，RSD 為2.12%。

2.3.8 樣品含量測定

樣品按2.3.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取2 mL至試管中，按2.3.3測定吸光度值，計算其含量。

2.4 總蛋白含量的測定

2.4.1 供試品溶液的制備

取油茶籽種仁粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入30 mL石油醚溶液，密塞超聲脫脂15 min，過濾，揮干溶媒，加入蒸餾水30 mL，超聲提取20 min，過濾、將濾液定容至100 mL容量瓶中，取8 mL濾液于10 mL離心管中以8 000 r/min離心15 min，取上清液，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備

精確稱取干燥至恒重的牛血清蛋白對照品6.25 mg于25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配成濃度為0.25 mg/mL的對照品溶液，置冰箱中備用。

2.4.3 標準曲線的繪制

精密吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至試管中，加蒸餾水補足至1 mL，搖勻。分別在試管中加入Lowry法蛋白質含量測定試劑盒中的試劑A 5 mL，搖勻，于室溫放置10 min，再加入試劑B 0.5 mL，立即搖勻，于室溫放置30 min。以1 mL蒸餾水作空白對照，同法操作，在750 nm波長處測定其吸光度值。以濃度為橫坐標(x)，吸光度值為縱坐標(y)，繪制標準曲線，結果總蛋白的標準曲線方程為 y=2.897 3x+0.005 4，r=0.999 5(n=6)，線性范圍0.025 ～0.250 mg。

2.4.4 顯色穩定性試驗

取同一供試品溶液，按2.4.3操作，每隔0.5 h測定其吸光度值，結果RSD為2.42%(n=5)，表明供試品溶液在顯色后2 h內穩定。

2.4.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液6份，各0.4 mL，加蒸餾水補足至 1 mL，按 2.4.3連續測定，結果 RSD為2.28%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復性試驗

按2.4.1平行制備6份供試品溶液，測定其吸光度值，結果RSD為3.08%，表明方法重復性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一供試品6份，各0.05 g，分別加入適量牛血清蛋白對照品溶液，按2.4.1制成供試品溶液，測定吸光度值，計算回收率為101.9% ～104.8%，RSD 為 1.01%。

2.4.8 樣品含量測定

樣品按2.4.3制成供試品溶液，平行3份，精密吸取1 mL至試管中，按2.4.3測定吸光度值，計算其含量。

3 結果與分析

“長林”系列10個品種油茶籽種仁中總蛋白、總三萜、總多糖和總黃酮4類主要功能性成分測定結果列于表2。

表2 不同品種油茶籽種仁中總三萜、總黃酮、總多糖和總蛋白含量(n=3)

從表2可見，油茶籽種仁中總蛋白為12.96% ～17.38%，長林4號最高，長林166號、21號、18號次之(3個品種間無顯著差異)，長林40號最低;總三萜為2.56% ～5.37%，長林4號最高，長林27號、53號次之，長林55號最低;總多糖為0.65% ～1.43%，長林40號最高，長林53號、27號次之，長林180號最低;總黃酮為0.53% ～1.06%，長林53號、3號最高，長林27號次之，長林21號最低。分析結果表明，各類功能性成分在品種間均存在較大的差異。

“長林”系列油茶籽種仁中4類功能性成分含量高低依次為總蛋白＞總三萜＞總多糖＞總黃酮，四者間含量無顯著相關性。結合文獻中其含油率進行分析(長林180號未經國家審定，缺含油率數據，未計算在內)，結果表明含油率與總三萜(R=－0.747，P ＜0.05)和總黃酮含量(R= －0.731，P ＜0.05)均呈顯著負相關。

4 討論與結論

本試驗在4類功能性成分含量測定方法的建立過程中，分別考察了提取溶劑、物料比等因素。總三萜分別用50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、甲醇和二氯甲烷進行回流提取，結果表明甲醇提取率最高;物料比為1/50時提取的供試品溶液吸光度值在標準曲線線性范圍之內。總黃酮分別用50%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、甲醇進行回流和超聲提取，結果表明甲醇回流提取率最高;物料比為1/50提取的供試品溶液直接測定吸光度值過低，經試驗，濃縮10倍后符合標準曲線線性范圍。總多糖和總蛋白的提取，考察了樣品稱樣量和終溶液體積，分別以0.5 g/250 mL和0.1 g/100 mL制備的供試品溶液測得吸光度值符合標準曲線線性范圍。紫外分光光度法操作簡便穩定、測定結果可靠，可用于4類功能性成分含量的測定。

“長林”系列油茶籽種仁中均含有豐富的蛋白、三萜、多糖和黃酮類成分，這4類功能性成分含量在油茶品種間均存在較大差異，但含量之間無顯著相關性。含油率與總三萜和總黃酮含量均呈顯著負相關，這可能是由于種子成熟后期，脂肪酸類和淀粉(多糖類)成分迅速增加，含量上升明顯，而三萜類成分基本穩定，相對種仁總重量的增加，表現為含量下降［11］。

4類功能性成分中，總蛋白和總三萜含量均以長林4號最高，總多糖含量以長林40號最高，總黃酮含量以長林53號和3號最高。因此，針對油茶不同功效產品的開發應選擇相應的品種。

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