籽瓜種子蛋白質(zhì)組成及其提取工藝優(yōu)化的研究

張 超 郭曉飛 李 武 馬 越 王 丹 趙曉燕

(北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

籽瓜(Citrullus vulgaris L.)，又名打瓜，屬葫蘆科一年生草本植物，原產(chǎn)地為非洲西南部卡拉哈迪沙漠中。我國(guó)籽瓜種植主要分布在甘肅、內(nèi)蒙、新疆等地區(qū)，年產(chǎn)量超過(guò)百萬(wàn)噸［1］。籽瓜種子蛋白質(zhì)含量為36% ～40%，其必需氨基酸除賴氨酸外均達(dá)到或超過(guò)FAO(聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織)推薦的標(biāo)準(zhǔn)［2－3］，是一種優(yōu)良的植物蛋白資源。研究表明籽瓜種子蛋白質(zhì)除了可作為人體外源性蛋白質(zhì)優(yōu)良補(bǔ)充劑外，其還可以高效螯合鋅離子和鐵離子，從而幫助人體補(bǔ)充礦物質(zhì)［4］。近年來(lái)，花生［5］、椰子［6］、杏仁［7］和沙棘［8］等的蛋白質(zhì)均采用堿溶酸沉法的取得良好的提取效果，而籽瓜種子的研究主要集中在促進(jìn)其萌芽方法及其健康生產(chǎn)的研究，僅張玉秀等［2］對(duì)其氨基酸和脂肪酸組成進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和比較。

本研究在前人的基礎(chǔ)上，對(duì)民籽1號(hào)籽瓜種子蛋白質(zhì)的基本組成進(jìn)行分析，評(píng)估其氨基酸組成;并利用響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化其蛋白質(zhì)提取工藝，通過(guò)回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得最優(yōu)工藝條件，為其后續(xù)對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)的功能評(píng)價(jià)、功能肽的研究奠定夯實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜種子:民籽1號(hào)，甘肅省民勤縣金谷源農(nóng)業(yè)科技有限公司;大豆、花生、葵花籽:市售;乙醚沸程(30～60℃)，氫氧化鈉，濃鹽酸，硫酸銅，硼酸，酒石酸鉀鈉均為分析純(AR):北京化工廠;酪蛋白:北京奧博星生物技術(shù)有限公司;福林酚試劑:美國(guó)Sigma公司。

1030 Analyzer凱氏定氮儀:瑞士 Tetator公司;FE20pH計(jì):瑞士Mettler Toledo公司;3－18K冷凍離心機(jī):德國(guó)Sigma公司;UV－1800紫外可見(jiàn)分光光度儀:日本島津公司;ALPHA2－4LD冷凍干燥機(jī):德國(guó)Chirst公司。

1.2 籽瓜種子組成檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)含量測(cè)定依據(jù) GB/T 5009.5—2010采用凱氏定氮法;提取液中蛋白質(zhì)采用福林－酚比色法測(cè)定［9］;粗脂肪含量測(cè)定依據(jù) GB/T 14772—2008采用索氏提取法進(jìn)行測(cè)定;水分含量依據(jù)GB/T 5009.3—2010采用常壓干燥法進(jìn)行測(cè)定;灰分含量測(cè)定依據(jù)GB/T 5009.4—2010采用干法灰化法測(cè)定;氨基酸組成參考GB/T 5009.124—2003采用氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定。

1.3 脫脂籽瓜種子粉的制備

利用萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)籽瓜種子進(jìn)行粉碎處理，然后按1∶4的比例使用乙醚對(duì)籽瓜種子脫脂，脫脂溫度為50℃，時(shí)間為8 h;然后把籽瓜種子粉置于通風(fēng)櫥中干燥8 h，再置于鼓風(fēng)干燥機(jī)50℃干燥12 h。

1.4 籽瓜種子蛋白質(zhì)的提取工藝

籽瓜種子粉按1∶10加入去離子水，調(diào)節(jié)pH值(0.5 mol/L 的 HCl或 0.5 mol/L 的 NaOH)，在水浴中攪拌，3 500 r/min下離心15 min，調(diào)節(jié)上清液至pH 5.0(預(yù)試驗(yàn)證明籽瓜種子蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH 5.0附近)，離心棄去上清液得洗沉淀，調(diào)節(jié)體系至pH 7.0，冷凍干燥獲得籽瓜種子蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的提取率采用公式1進(jìn)行計(jì)算。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在溫度為35℃，時(shí)間60 min，考察不同pH值(8、9、10、11和12)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響;在pH為11，時(shí)間為 60 min，考察不同溫度(25、35、45、55 和65℃)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響;在 pH 11，溫度為55 ℃，考察不同時(shí)間(30、45、60、75 和 90 min)對(duì)提取率的影響。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其驗(yàn)證性試驗(yàn)

利用Box－Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取pH、溫度和浸提時(shí)間3個(gè)主因素，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，考察不同因素水平對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。因素水平表見(jiàn)表1。以響應(yīng)面得到的最佳工藝條件提取籽瓜種子蛋白質(zhì)，考察實(shí)際提取率與預(yù)測(cè)值之間的差異。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Oring 8.0(美國(guó)Origin Lab公司)對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像繪制;采用Design－Expert V8(美國(guó)Stat－easy公司)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用此軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)，考察各因素及交互作用的顯著性，置信區(qū)間為95%。

2 結(jié)果與討論

2.1 籽瓜種子組成分析

表2為籽瓜種子、大豆、花生和葵花籽的基本成分分析結(jié)果，籽瓜種子蛋白質(zhì)為36.2%，高于其他3種作物。同時(shí)其脂肪含量為45.7%，高于大豆。Wani等［10］測(cè)定籽瓜種子常規(guī)成分，粗蛋白和粗脂質(zhì)含量分別為16.34%和21.93%，二者的差異較大，產(chǎn)生的原因可能在于籽瓜的品種、生長(zhǎng)氣候和環(huán)境所造成的。

表2 籽瓜種子、花生、大豆和葵花籽基本成分分析

表3為籽瓜種子、大豆、花生和葵花籽的必需氨基酸組成分析結(jié)果，籽瓜種子蛋白中富含人體必需氨基酸，從必需氨基酸含量來(lái)看，大豆的最高，其次為籽瓜種子、葵花籽和花生，它們的含量分別為13.8%、11.6%、10.1% 和 9.11%，籽瓜種子的氨基酸組成與大豆的氨基酸組成較相似，但幾種作物必需氨基酸含量顯著低于FAO/WHO(1973 FAO規(guī)定標(biāo)準(zhǔn))的必需氨基酸均衡模式，但籽瓜種子蛋白必需氨基酸配比適宜;籽瓜氨基酸組成與張玉秀等研究結(jié)果存在一定差異，可能在于不同品種及生長(zhǎng)的環(huán)境所造成的［2］。

表3 必需氨基酸組成分析

2.2 pH對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響不明顯，因而試驗(yàn)均采用1∶10的料液比。圖1顯示不同pH對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響(料液比為1∶10，提取溫度為35℃，時(shí)間為60 min)。提取率隨pH的提高呈上升的趨勢(shì)，當(dāng)pH達(dá)到11時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率趨于穩(wěn)定。在pH 11時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到50.7%。籽瓜種子蛋白主要為球蛋白［11］，因而隨著環(huán)境pH的提高，球蛋白從籽瓜種子組織中擴(kuò)散出來(lái)［12］;隨著體系氫氧化鈉濃度的提高可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)有一定的裂解作用［13］，因而促使pH 12時(shí)的提取率略小于 pH 11的體系。選定pH 11為響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

圖1 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3 溫度對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

圖2 顯示溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響(料液比為1∶10，pH 11，浸提時(shí)間為60 min)。隨著浸提溫度的提高，提取率呈明顯的上升趨勢(shì)，在浸提溫度達(dá)到55℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)61.2%;溫度的升高加速分子間的擴(kuò)散，獲得更多的蛋白質(zhì)，同時(shí)也會(huì)使蛋白質(zhì)變性，影響提取率［8］。在西紅柿種子蛋白［14］、花生蛋白質(zhì)［15］、南瓜子蛋白質(zhì)［16］和沙棘蛋白質(zhì)［8］制備過(guò)程中，都呈現(xiàn)出隨溫度升高提取率先升高后下降的趨勢(shì)。因此選定55℃為中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.4 時(shí)間對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3 顯示時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響(料液比為1∶10，pH 11，浸提溫度為55℃)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到75 min時(shí)，逐漸趨于動(dòng)態(tài)的平衡;繼續(xù)提高浸提時(shí)間，對(duì)提取效率影響不大。考慮到節(jié)約成本、降低能源消耗，選擇75 min為宜。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果

進(jìn)一步采用Box－Beknhen中心組合試驗(yàn)優(yōu)化蛋白質(zhì)工藝參數(shù)，并用二次方程來(lái)表征因素水平與響應(yīng)值之間的數(shù)學(xué)模型:

式中:Y 為測(cè)定的響應(yīng)值;b0、bi、bii和 bij為二次回歸模型中的常數(shù)項(xiàng);Xi、Xj為不同變量的水平。其中每一個(gè)因素可分為線性部分、二次項(xiàng)部分和交互項(xiàng)部分，用來(lái)評(píng)估回歸方程的擬合效果，通過(guò)F檢驗(yàn)考察各因素及交互作用的顯著性［17］。表4為試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其對(duì)應(yīng)的提取率。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

利用Design Expert軟件對(duì)自變量編碼進(jìn)行回歸分析，得如下回歸方程:Y=0.64+0.016X1+0.012 X2+8.175E －003X3－5.500E －003X1X2－5.100E －003X1X3－3.750E －003X2X3－0.013X12－6.655E －003X22－0.012X32。并利用 Design－Expert軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)，考察各參數(shù)及其交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性程度。此回歸模型的變異系數(shù)和決定系數(shù)分別為1.46%和92.69%，表明該預(yù)測(cè)模型可較好反應(yīng)試驗(yàn)的真實(shí)情況;由方差分析表(表5)可知，時(shí)間對(duì)提取率的影響顯著(P＜0.05)，且溫度和pH對(duì)提取率影響極顯著(P＜0.01);但溫度與浸提時(shí)間，溫度與pH和pH與時(shí)間交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著;由方差分析表可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度依次為pH＞溫度＞時(shí)間。

表5 回歸模型的方差分析

響應(yīng)面圖可以直觀的反映不同因素對(duì)響應(yīng)值的影響［18］，圖4～圖6分別表示不同因素交互作用提取率的影響，比較圖4～圖6可知，溫度和pH的交互作用的響應(yīng)面圖最為陡峭，其次為時(shí)間與pH的交互作用;圖像的陡峭與否可以直觀放映各因素對(duì)試驗(yàn)的影響程度［19］。利用Design－Expert軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行求解，獲得最優(yōu)提取率為66.8%，把應(yīng)的編碼值其轉(zhuǎn)化為實(shí)際值，即pH 11.5、浸提溫度61.5℃、時(shí)間 77.0 min。

圖4 溫度與pH的交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖

圖5 時(shí)間與pH的交互作用對(duì)提取影響的響應(yīng)面圖

圖6 時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖

2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為考察數(shù)據(jù)的真實(shí)性，采用相應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取條件對(duì)籽瓜種子蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，試驗(yàn)重復(fù)3次，其蛋白質(zhì)提取率平均值為64.5%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為3.44%，該模型準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

對(duì)籽瓜種子的基本組成和氨基酸組成進(jìn)行評(píng)價(jià)，表明籽瓜種子為優(yōu)良蛋白質(zhì)資源;利用單因素和中心組合試驗(yàn)，獲得其蛋白質(zhì)的最佳提取工藝為pH 11.5、溫度61.5 ℃和時(shí)間77 min，該模型準(zhǔn)確、可靠，可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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