響應面優化冷榨花生粕酶法制備多肽工藝的研究

肖懷秋 李玉珍 林親錄 楊 濤 鄧 靖 龔春平

(湖南化工職業技術學院制藥與生物工程系1，株洲 412004)

(中南林業科技大學食品科學與工程學院2，長沙 410004)

(湖南工業大學包裝與材料工程學院3，株洲 412000)

(廣東佛山南海宏仁食品有限公司4，佛山 528000)

花生(Arachis hypogeal L.)屬豆科(Leguminosae)落花生屬一年生草本植物，是我國重要的油料與經濟作物。我國花生播種面積占全球花生播種面積約20%左右，年產量約500～650萬噸，榨油后產生的花生粕約150多萬噸［1］。花生粕中蛋白質含量高達50～70%(干基)［2］，由于其溶解度差而無法直接應用于食品工業，主要用于畜禽或魚類飼料和肥料，導致花生粕精深加工嚴重不足，優質的蛋白質資源未能得到充分深加工利用［3］。低溫冷榨花生粕由于其蛋白質、氨基酸、維生素和甾醇等有效成分沒有受到熱變性而保存較好，而且花生蛋白與大豆蛋白相比，含胃脹氣因子和抗營養因子少，與菜籽粕和棉子粕相比，含毒性物質較少。因此，是一類非常重要的植物蛋白質資源。花生粕蛋白經酶促水解后可以產生小分子蛋白質、多肽以及氨基酸，其中分子多肽比蛋白質的營養性能更好，生物吸收利用率比氨基酸更高，可直接為小腸黏膜吸收利用［4］。此外，花生肽還具有多種生理活性，如抗氧化、降血壓和抗菌等。蛋白質酶促水解制備的活性多肽已成為治療高血壓、糖尿病、癌癥、艾滋病、SARS等諸多疾病的特效或潛在藥物［5］，國外已有多肽藥物和營養產品推向市場，市場前景極為可觀［6］。本試驗以低溫冷榨花生粕為原料，通過堿性蛋白酶進行酶促水解，研究最佳酶促水解條件，為低值花生粕制備活性多肽提供技術支持，也為其蛋白質資源的精深加工提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

低溫冷榨花生粕:德州宏鑫花生蛋白食品有限公司;堿性蛋白酶:北京鴻潤寶順科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器與設備

LABCONCO冷凍干燥儀:美國 Labconco公司;HERMLE Z323K冷凍離心機:德國Hermle公司;722型可見分光光度計:上海舜宇恒平科學儀器有限公司;pHS－3C pH計:上海儀電科學儀器股份有限公司;KQ－300DE型數控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生粕蛋白質提取工藝

低溫冷榨花生粕→烘干→粉碎→堿溶兩次(1 mol/L NaOH 調 pH 8.5，料液比 1∶15，50 ℃，2 h)→離心(4 000 r/min，15 min)→上清液酸沉(3 mol/L檸檬酸調pH 4.5左右，室溫靜置30 min)→離心(4 000 r/min，15 min)→收集蛋白凝塊→醇洗2次→加堿調整pH 6.5→真空冷凍干燥→花生蛋白粉

1.3.2 花生粕蛋白質酶解工藝

準確稱取一定量的花生蛋白粉于反應器中，依據固液比要求添加適量蒸餾水攪拌至分散均勻，超聲預處理10 min并于90℃預熱10 min，冷卻至室溫后調整到預設pH值，根據蛋白酶活力并結合酶/底物配比精密準確稱取堿性蛋白酶添加到酶解反應器中，緩慢攪拌，酶解過程中注意維持酶解系統pH恒定。酶解結束后將酶解液迅速置于沸水浴中滅酶10 min。冷卻至室溫后4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.3 多肽測定

參考白永蓮等［6］報道方法，略有改動。精密移取酶解液1 mL，加入雙縮脲試劑4 mL作為測定管;精密量取7%標準蛋白0.05 mL加0.9%NaCl 0.95 mL，再加4 mL雙縮脲試劑作為標準管;精密移取0.9%NaCl溶液1 mL加雙縮脲試劑4 mL作為空白管，分別于525 nm波長處測定吸光值。多肽含量按下式計算:

多肽質量分數 =［(A測－A空)/(A標－A空)］×7% ×0.05

1.3.4 Min Run Equirelicated Res IV 析因設計

該析因設計方法能以較少的試驗次數從眾多影響因素中快速有效地篩選出主要顯著影響因素(主效因子)。擬考察酶濃度［E］、底物濃度［S］、酶解溫度、酶解時間和酶解pH等因素對多肽含量的影響，因素與水平見表1。

表1 析因設計因素與水平表

1.3.5 爬陡坡試驗

響應面優化所擬合的多元非線性回歸方程只有在考察的最優鄰域里才能充分近似真實情況，若遠離最優鄰域，則擬合的回歸方程與實際條件會不一致，甚至沒有實際意義［7］。為此，基于析因設計結果并結合回歸方程模型系數符號及大小設置步長及變化方向，使主效因子同時逼近最優鄰域，以獲得較優區域。

1.3.6 響應面法優化

中心復合設計(central composite design，CCD)具有靈活性和作為序貫試驗設計的有用性，其靈活性取決于星號臂!和中心點數目n。CCD在基本保留回歸正交設計試驗次數的前提下，通過犧牲部分正交性而獲得旋轉性，由此可簡化計算和部分消除回歸系數之間的相關性以及克服預測值方差過分依賴于試驗點在因子空間中的位置的不足，可以很好的根據預測值直接尋求最優區域。每因素設5水平，即±r(上下星號臂)，±1(上下水平點)和0(零水平)。本試驗中心點試驗為6次。數據擬合模型可表示為:

式中:y為響應值(多肽含量)，β0為模型截距，βi為線性項回歸系數，βii為二階項回歸系數，βij為模型交互項回歸系數，Xi和Xj是獨立自變量(考察因素)，ε為模型誤差，ε～N(0，σ2)。

用 Design expert (Version 8.0.6，Stat－ Ease，Inc.，Minneapolis，MN)研究酶濃度(X1)、底物濃度(X2)和酶解時間(X3)對多肽生成的影響，因素水平與編碼見表2。

表2 中心復合設計因素水平與編碼

1.3.7 驗證試驗

在優化試驗條件下重復6次試驗，測定酶解液中多肽含量以驗證優化試驗條件的穩定性。

2 結果與分析

2.1 Min Run Equirelicated Res IV 析因設計

酶濃度(X1)、底物濃度(X2)、酶解 pH(X3)、酶解溫度(X4)和酶解時間(X5)對多肽含量影響如表3所示。

表3 析因設計編碼與試驗結果

經回歸分析得到回歸方程為 y=0.078+0.026x1+0.016x2+6.464E － 003x3+2.558E －003x4+7.465E－003x5。顯著性分析表明模型極顯著(P=0.0 043＜0.01)。百分貢獻率分析發現，酶濃度［E］、底物濃度［S］、酶解時間和酶解 pH為重要因素，特別是［E］和［S］，累積百分貢獻率和為72.43%。顯著性分析發現，［E］和［S］影響極顯著(P＜0.01)，酶解pH和酶解時間影響顯著(P ＜0.05)，酶解溫度影響不顯著(P=0.2 798 ＞0.05)，各因素影響均為正影響，宜適當提升各因素水平。

2.2 爬陡坡設計

基于析因設計結果進行爬陡坡設計，各因素爬坡試驗方向及步長如表4所示。

表4 爬陡坡試驗結果

由表4可看出，試驗組 3號多肽含量最高(0.126%)，因此，以該試驗條件為CCD的中心點。

2.3 響應面優化結果與分析

2.3.1 數學模型的建立

對酶濃度(X1)、底物濃度(X2)和酶解時間(X3)進行中心復合設計響應面優化試驗，結果如表5所示。

表5 中心復合響應面優化試驗設計結果(含模型預測值)

對表5數據進行多元回歸擬合可求出影響因素的一次、二次及交互效應關聯方程，即 y=0.20+0.015x1+0.010x2+0.019x3+8.250E － 003x1x2+6.250E －003x1x3+4.500E －003x2x3－0.034x12－0.040x2－0.026x32。

2.3.2 模型方差分析與回歸方程顯著性分析

模型方差分析結果如表6。

表6 回歸模型方差分析表

由表6可看出，模型極顯著(P＜0.000 1)，模型失擬項不顯著(P=0.050 9＞0.05)，說明用此二階回歸模型對數據進行擬合是合適的，不需用更高階模型進行數值模擬。回歸模型R2=0.966 1，RAdj2=0.935 7，說明該模型可以解釋總變異的93.57%。模型信躁比為13.641，大于4，說明模型精度是符合要求的［8］。

表7 回歸方程系數顯著性檢驗表 (全模型)

對回歸方程進行系數顯著性分析檢驗，結果如表7所示。由表7可以看出，模型一次項x1和x3影響為極顯著(P ＜0.01)，x2影響顯著(P ＜0.05)。二次項x12，x22和x33均極顯著(P ＜0.01)，模型交互作用項 x1x2，x1x3和 x2x3影響均不顯著(P ＞0.05)。

2.3.3 回歸擬合模型診斷

模型正確性可通過殘差分析進行評價。用內部t化殘差進行模型分析是基于模型無法完全解釋變異基礎上進行的。殘差分析主要以圖形方法進行評價［9］。在模型診斷中，開展誤差方差齊性檢驗是非常有必要的，因為如果模型選擇合適，其殘差呈正態分布［10］。由圖1A可以看出，預測值的內部t化殘差分布是隨機分布的，所以，殘差方差齊性是符合要求的。除此之外，合理的模型還要求模型殘差要呈正態概率分布［11］，模型殘差正態分布如圖1B所示。由圖1B可以看出，殘差分布呈正態性且相互獨立。因此，本試驗擬合的數值模型是可行的。

圖1 模型診斷圖和殘差正態分布概率圖

2.3.4 響應面優化分析

響應面圖是所擬合的數值模型在數據區域的圖形化表征［9，12］。在響應面分析中，若觀察某兩個因素同時對響應值的影響可借助降維分析［13］，即在其他因素條件固定在零水平的情況下，觀察兩個因素對響應值的影響并得到影響的二次方程以及響應面圖和等高線圖。等高線圖能直觀反映因素交互作用對響應值的影響，圓形表示因素間交互作用不明顯，橢圓形則表示交互作用顯著。由圖2可以看出，x1x2，x2x3和 x1x3交互作用不明顯(P ＞0.05)。設計篩選出主效因子并借助爬陡坡試驗使各主效因子同時逼近最優鄰域，確定中心復合設計中心水平，然后利用中心復合響應面設計對酶解條件進行了優化并獲得最優酶解條件，即酶濃度［E］=4 300 U/［S］，底物濃度［S］=10.0%和酶解時間為85 min，最優條件下進行驗證試驗以考察模型擬合度及試驗穩定性，試驗結果為(0.209 ±0.005)%(n=6)，接近模型預測值，說明該模型可很好的用于冷榨花生粕蛋白質酶促水解制備活性多肽工藝的預測。

圖2 y=f(X1，X2)，y=f(X1，X3)和 y=f(X2，X3)等高線圖

2.3.5 方程最優解求解與驗證試驗

將回歸方程分別對各自變量求偏導數并令其等于零，可得到下列三元一次方程組:

利用Maxima5.20.1進行規劃求解可得到方程解分別為 x1=0.28，x2=0.19 和 x3=0.42。經轉換，可得到實際的因素水平為酶濃度［E］=4 333 U/［S］，底物濃度［S］=10.23%，酶解時間為 85.04 min。為實際操作方便，將試驗條件修約為酶濃度［E］=4 300 U/g［S］，底物濃度［S］=10.0%和酶解時間為85 min。在最優條件下進行驗證試驗，酶解液中多肽質量分數為(0.209 ±0.005)%(n=6)，與預測值0.207 8%接近，偏差為5.77%。

3 討論與結論

超聲波借助空化作用與機械作用可斷裂蛋白質中化學鍵，有利于改善酶解環境并使酶解效率得到有效提升，還可改善花生蛋白質酶解后的營養與生物學功能［14］。蛋白酶酶促水解是一個高度復雜的非線性過程，酶解過程具有高度的產物多樣性與動力學復雜性［5］。為了對酶解過程進行數值分析并研究各因素對響應值(多肽含量)的影響，本文利用析因

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