紅小豆栽培品種胰蛋白酶抑制劑的含量及特性研究

江均平 李春紅 張 濤 云冬梅 楊雪豐

(中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室1，北京 100193)

(中國農業科學院作物科學研究所2，北京 100081)

(北京農學院3，北京 102206)

胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一類物質，廣泛存在于動物、植物和微生物中，在體內能與相應的胰蛋白酶形成一定的動態平衡，調節生物體內許多重要的生命活動。

現代研究表明，TI對潰瘍性結腸炎［1］、輻射損傷［2－3］、HIV 和腫瘤［4－6］等有一定的療效;農業上，TI可以用于病蟲害防治;食品工業，TI可以用來抑制蛋白酶，防止香腸、肉丸、低鹽魚產品、海洋藍鲹魚糜凝膠軟化［7－8］，改善肉類食品的質構。但是，TI是一種抗營養因子，可降低蛋白質的消化利用，造成胰腺分泌失調性肥大和增生［9］，引起體內含硫氨基酸的內源性散失致使體內氨基酸代謝失調或不平衡。因此，如何科學食用紅小豆使之最大發揮保健效果又不抗營養也是需要解決的問題。

紅小豆(Vigna angularis)原產于中國，已有2000多年的栽培史，印度、緬甸、朝鮮、日本等國均有栽培，在膳食結構中占有十分重要的地位。臨床證實紅小豆粉外敷治療病毒性腮腺炎和化膿性腦膜炎并硬腦膜下積液有特效［10－11］，雖然其治療機理尚不清楚，但與紅小豆中含有大量的胰蛋白酶抑制劑可能有關。紅小豆每克含(458.55±5.90)UTI，經90 ℃處理60 min活性未見重要變化，在pH 4～10室溫放置30 min未見失活，在 pH 2～3下降約5%［12］，可以作為蛋白酶抑制劑用于食品加工防止凝膠軟化，因此紅小豆是生產TI的潛在資源。但由于所研究的紅小豆種質數量少，尚難全面體現不同種質胰蛋白酶抑制劑的含量及特性。本研究收集了一定數量的紅小豆品種，測定了其TI含量，并對3種高產品種TI的種類及穩定性進行了研究，以便為我國紅小豆資源的開發利用以及科學食用紅小豆提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

18份紅小豆品種種子來自我國主產區(2010年產);苯甲酰－DL－精氨酸－對硝基酰胺鹽(BAPNA):Sigma公司;胰蛋白酶(1∶250)(Trypsin＞250 N.F.U/mg):Bio Basic Inc.公司。

1.2 儀器設備

TP－114電子分析天平:美國丹佛公司;UV－752紫外可見分光光度計:上海元析儀器有限公司;1093 CYCLOTEC旋風磨:瑞典Foss公司;DYY－8C電泳儀:北京六一儀器公司。

1.3 TI的提取

將豆混勻，取約50 g紅小豆用旋風磨磨成80目，裝于塑料袋，置于冰箱備用。取(1 000.0±1.0)mg紅小豆粉用20 mL蒸餾水于150 mL三角瓶中，180 r/min振蕩提取1 h(37℃)，12 000 r/min離心10 min得TI提取液。

1.4 胰蛋白酶抑制劑活力測定

參照 AACC，1999［13］、燕方龍等［14］的方法進行。于試管中依次加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH 8.2 Tris－HCl緩沖液、0.2 mL TI溶液、0.2 mL 0.8 mg/mL 胰蛋白酶溶液(40 mg胰蛋白酶用2 mL 1 mmol/L鹽酸溶解，蒸餾水定容至50 mL)，37℃保溫5 min后，加入 0.5 mL 0.4 mg/mL BAPNA 溶液(20.0 mg BAPNA用0.5 mL二甲基亞砜溶解，用20 mmol/L CaCl2－0.05 mol/L、pH 8.2 Tris－ HCl緩沖溶液定容至50 mL，臨用前配制)，保溫10 min后加入0.2 mL 30%乙酸，混勻，以空白對照(反應時最后加酶液)作參比，測定410 nm的吸光度。抑制率控制在40%～60%。每個樣品設3個重復，每個重復設2個平行反應管，以3個重復的平均測定結果±標準差表示樣品中TI的含量。

抑制劑活性單位定義:在上述反應條件下抑制1 mg 1∶250的胰蛋白酶活性所需要的抑制劑量為1單位(TIU)。

1.5 高溫對抑制劑穩定性的影響

取0.5 mL提取液于離心管中，加入0.5 mL蒸餾水，100℃水浴30 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清液進行電泳及測定殘余活性。

1.6 酸性條件對抑制劑穩定性的影響

吸取0.5 mL上清液于離心管中，再加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH 1.5 的 KCl－ HCl緩沖液，37 ℃靜置8 h，然后進行電泳及測定殘余活性。

1.7 TI多型性電泳分析

參照黃國偉等［15］、Felicioli等［16］的方法進行。取(1 000.0±1.0)mg豆粉用50 mL蒸餾水于150 mL三角瓶中180 r/min振蕩提取1 h(37℃)，12 000 r/min離心10 min得TI提取液，用蒸餾水稀釋5倍，與等體積電泳樣品緩沖液混合，取20 μL進行明膠－PAGE。采用不連續垂直平板電泳系統，濃縮膠濃度5%，分離膠12%，2種膠均含0.2%明膠，電極緩沖液為pH 8.3 Tris－甘氨酸，濃縮膠電壓80 V，分離膠150 V，電泳畢，用100 mL 胰蛋白酶(25 μg/mL，用脫酶液配制)酶解 20 min(搖床轉速 50 r/min、37℃)，然后將酶液倒干盡使凝膠緊貼培養皿，倒置培養皿37℃酶解60～90 min，然后用150 mL脫酶液(0.05 mol/L、pH 7.5 Tris － HCl－0.2 mol/L NaCl－0.01 mol/L CaCl2)分3次漂洗膠板，每次2 min。考馬斯亮藍R－250染色60 min(37℃，搖床轉速50 r/min)，0.25 mol/L NaCl溶液脫色。

1.8 統計分析

品種TI含量測定為3個重復，以3個重復的平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 紅小豆品種TI含量

我國17個紅小豆品種TI含量見表1。17個品種 TI含量范圍為(236.0 ±13.6)～(541.1 ±12.8)TIU/g，平均值 410.8 TIU/g，品種之間高低相差 2.3倍。電泳酶譜結果顯示，紅小豆TI含量低于黑大豆，高于綠豆(圖1)。

在測試的17個品種中有4個品種超過500 TIU/g，占總數的23.5%。京農21、遼引紅豆和XD1 TI含量最高，分別為(541.1 ±12.8)、(531.5 ±7.5)和(528.3 ±14.3)TIU/g，具有潛在的開發價值，故對這3個品種的TI作進一步分析。

表1 不同紅小豆品種胰蛋白酶抑制劑含量(TIU/g種子)

2.2 紅小豆TI種類

用非變性電泳TI活性染色方法對TI含量最高的京農21、遼引紅豆、XD1 TI的種類進行分析，結果見圖1。紅小豆有7條TI帶，其中A4、A2和A6為主帶。種植在白城的京農21其A2、A3含量極低或者無，而種植在北京的京紅21有A2、A3(圖2)，表明種植環境對紅小豆TI含量和種類有影響。黃國偉等［15］對1份市售小豆的TI種類進行了分析，發現有7條帶。據報道，TI含量與植物品種、生理狀態以及受病蟲侵害程度有關［17］。

圖1 綠豆、紅小豆、黑大豆PAGE TI譜

圖2 不同產地紅小豆PAGE TI譜

紅小豆、綠豆、黑大豆3種豆的TI種類不同，綠豆只有4種TI，紅小豆有7種，黑大豆有8種。

TI在生物體內擔負多種生理功能，需要不同種類及豐度的TI才能滿足要求，豆類TI多型性的生物學意義值得深入研究。

2.3 紅小豆TI熱穩定性和酸穩定性

經沸水處理30 min或經pH 1.5處理8 h，3種紅小豆TI的活性可以保存92.2%以上(表2)。Gelatin－PAGE TI譜分析表明，經熱處理或酸處理，京農21的A7的活性下降明顯，其他TI帶穩定;遼引紅豆7條帶均較穩定;XD1中7種TI對酸較穩定，對熱穩定性稍差(圖3)。Klomklao等［12］報道紅小豆TI經90℃處理60 min活性未見重要變化，在pH 4～10室溫放置30 min未見失活，在pH 2～3下降約5%。據報道，紅小豆TI由82個氨基酸殘基組成，分子中含有7對二硫橋［18］，故具有很高的熱穩定性和酸穩定性。

表2 紅小豆TI穩定性

圖3 熱、酸處理紅小豆PAGE TI譜

這些結果表明紅小豆TI耐熱、耐酸，可以應用于各種食品熱加工工藝，口服時胃酸也不會導致失活，具有潛在的應用價值。

3 結論

我國紅小豆品種平均含 TI 410.8 TIU/g，有23.5%的品種其TI含量超過500 TIU/g，表明我國有大量高產TI的紅小豆資源。紅小豆TI耐熱耐酸，有可能用于各種熱加工工藝防止蛋白酶引起軟化，胃中pH不會破壞其活性，是生產TI的潛在原料;紅小豆含7種TI，比綠豆多4種，生長環境對TI的種類和含量有影響。

［1］Gary R，Lichtenstein Julius J，Deren Seymour Katz James D，et al.Bowman － Birk inhibitor concentrate:a novel therapeutic agent for patients with active ulcerative colitis［J］.Digestive Diseases and Sciences，2008，53(1):175 －180

［2］Katoh H，Ishikawa H，Hasegawa M，et al.Protective effect of urinary trypsin inhibitor on the development of radiation－induced lung fibrosis in mice［J］.Journal of Radiation Research(Tokyo)，2010，51(3):325 －32

［3］Klaus Dittmann，Claus Mayer，Rainer Kehlbach H，et al.The radioprotector Bowman－Birk proteinase inhibitor stimulates DNA repair via epidermal growth factor receptor phosphorylation and nuclear transport［J］.Radiotherapy and Oncology，2008，86(3):375 －382

［4］Fang EF，Hassanien AA，Wong JH，et al.Isolation of a new trypsin inhibitor from the Faba bean(Vicia faba cv.Giza 843)with potential medicinal applications［J］.Protein and Peptide Letters，2011，18(1):64 －72

［5］Ma DZ，Sun J，Zhang GQ，et al.A storage protein － like Trypsin inhibitor from the Moth Bean(Phaseolus acutifolius)with antiproliferative activity toward lymphoma cells［J］.Protein and Peptide Letters，2010，17(6):782 －8

［6］Vincent S M HO，T B NG.A Bowman －Birk trypsin inhibitor with antiproliferative activity from Hokkaido large black soybeans［J］.Journal of Peptide Science，2008，14(3):278 －282

［7］Garcia － carreno F L Toro M A N，Diazcopez.M.P.，et al.Proteinase inhibition of fish muscle enzymes using legume seed extracts［J］.Journal of Food Protection，1996，59(3):312－318

［8］Sun LC，Yoshida A，Cai QF，et al.Mung bean trypsin inhibitor is effective in suppressing the degradation of myofibrillar proteins in the skeletal muscle of blue scad(Decapterus maruadsi)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(24):12986－92

［9］V Kamalakannan，A V Sathyamoorthy，D B Motlag.Inhibitory fraction on the pancreatic activity of male Albino Mice［J］.Research in Experimental Medicine，1984，184:91 －101

［10］張明利，袁效函.赤小豆粉外敷治療流行性腮腺炎46例［J］.中國民族民間醫藥雜志，2000，44:141 －141

［11］張錫香，王愛然.紅小豆加雞子白調和外敷前囟治療硬腦膜下積液［J］.河北中醫，2006，3:219－219

［12］Sappasith Klomklao，Soottawat Benjakul，Hideki Kishimura，et al.A heat－ stable trypsin inhibitor in adzuki bean(Vigna angularis):effect of extraction media，purification and biochemical characteristics［J］.International Journal of Food Science and Technology，2010，45(1):163 －169

［13］AACC.AACC International Method 22 － 40.01:measurement of trypsin inhibitor activity of soy products－spectrophotometric method［M］.//AACC.Approved Methods of A-nalysis，11th ed.1999

［14］燕方龍，華蕾.大豆制品中胰蛋白酶抑制劑的抑制活性測定［J］.理化檢驗 －化學分冊，2007，3:226－228

［15］黃國偉，巫光宏，何嘉雯，等.測定豆類胰蛋白酶抑制劑活性和種類的電泳方法改良［J］.大豆科學，2010，2:315－318

［16］R Felicioli，B Garzelli，L Vaccari，et al.Activity staining of protein inhibitors of proteases on gelatin－containing polyacrylamide gel electrophoresis［J］.Analytical Biochemistry，1997，244(1):176 －179

［17］El－ Shamei Z，Wu J W，Haard N F.Influence of wound injury on accumulation of proteinase inhibitors in leaf and stem tissues of two processing tomato cultivars［J］.Journal of Food Biochemistry，1996，20(5):155 －171

［18］Chikako Ishikawa，Shin Nakamura，Kazue Watanabe，et al.The amino acid sequence of adzuki bean proteinase inhibitor I［J］.FEBS LETTERS，1979，99(1):97 － 100.