晚期氧化蛋白產物對人巨噬細胞產生NO、ROS的影響及復方黃甘提取物的干預

毛 萍， 莫立乾， 肖小燕， 宋少練， 楊西曉

(南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東廣州510515)

1996 年Witko-Sarsat等［1］首先報道，晚期氧化蛋白產物 (Advanced oxidation protein products，AOPP)系因患者體內過高的氧化應激水平導致各種蛋白質氧化損傷所形成的終末產物的總稱。血漿晚期氧化蛋白產物水平增高促使該分子在腎臟和血管等組織中沉積，通過促發炎癥正反饋導致單核細胞持續活化，從而參與全身性炎癥反應的發生和發展，與慢性腎病的進展及動脈粥樣硬化病變的發生發展密切相關。活性氧 (ROS)是一類具有高度反應活性的含氧化合物總稱，當ROS產生過多超出了機體的清除能力和/或機體抗氧化能力下降不能及時清除機體內產生的ROS時，機體就會產生氧化應激損傷［2-3］。一氧化氮 (NO)是一種極不穩定的生物自由基，當其作用于蛋白，脂質，核酸等可以引起細胞結構和功能的改變［4］。它介導的生物學作用包括擴張血管、神經傳遞，抑制血小板聚集、激活內皮細胞、炎性反應、脫噬作用、神經傳遞、抗病原體和抗腫瘤［5-7］。Zhou等［8］報道晚期氧化蛋白產物水平的增高促進炎癥反應;Kishimoto等［9］報道巨噬細胞在炎癥反應介導的細胞增殖方面發揮重要作用，張志輝等［10］發現晚期氧化蛋白產物可通過激活單核細胞釋放ROS，李忠海等［11］發現晚期氧化蛋白產物能抑制小鼠腹腔巨噬細胞誘導型一氧化氮的產生，但晚期氧化蛋白產物對人巨噬細胞有何影響還不甚明了。

復方黃甘顆粒是我院研制出的防治慢性腎衰(CRF)的純中藥制劑中成藥，它的主要成分有大黃、甘草等。本實驗室曾報道［12］該藥可降低血清肌酐、尿素氮，延緩腎衰進展。進一步的實驗［13］證實復方黃甘提取物可顯著降低慢性腎衰模型動物體內的晚期氧化蛋白產物水平。因此推測復方黃甘提取物對晚期氧化蛋白產物有一定的清除能力或可逆轉晚期氧化蛋白產物對機體的不良作用。但對其發生作用的途徑和機理尚不清楚。因此，本實驗旨在研究復方黃甘提取物對晚期氧化蛋白產物誘導的人單核細胞 (THP-1)源性巨噬細胞產生NO和ROS的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 THP-1細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所;無內毒素牛血清白蛋白 (BSA)、四甲基偶氮唑藍 (MTT)、2，7-二氫二氯熒光素二酯 (DCFH-DA)、PMA(佛波醇酯)均購自sigma公司;RPMI1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司;復方藥材均購自廣東康美藥業，均由南方醫科大學中藥鑒定教研室張宏偉教授鑒定;Trizol試劑盒和RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，PCR引物合成 (Invitrogen公司)，其余為國產分析純。

1.2 儀器 1285型CO2細胞培養箱 (美國Thermo公司);BX51正置熒光顯微鏡及照相系統 (日本Olympus公司);SpectraMax M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司);RE—52A旋轉蒸發儀 (鞏義市予華儀器有限公司);ZK—828型真空干燥箱 (上海實驗儀器總廠);5810R低溫離心機 (德國Ependorf公司);SB25—12YDTD超聲波清洗器 (寧波新芝生物科技有限公司);ABI 7500熒光定量PCR儀 (美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 復方黃甘提取物的制備 復方黃甘顆粒全方藥材加十倍量水，煎煮兩次，每次1.5 h棄渣收集提取液，并將其濃縮至1∶2(mL∶g)，藥液放冷后邊攪拌邊緩慢加入乙醇使其達80%含醇量，密閉冷藏24 h，濾過，濾液旋轉蒸發去除大部分乙醇，再60℃真空干燥得復方黃甘水提醇沉部分干浸膏，用DMSO溶解配制成母液，待實驗時用完全培養基配制成相應質量濃度。

1.3.2 無內毒素晚期氧化蛋白產物的制備與鑒定晚期氧化蛋白產物的制備參考Witko-Sarsat等［14］介紹的經典方法:將無內毒素的BSA(20 g/L)與次氯酸鈉40 mmol/L以1/140的等摩爾比例混合均勻，室溫反應30 min，制備出晚期氧化蛋白產物，其在無菌PBS(pH 7.4)中4℃透析24 h，以除去游離的次氯酸鈉，過濾除菌后4℃保存備用。按照Witko-Sarsat等［1］的紫外分光光度計法，于酸性條件下、340 nm測定晚期氧化蛋白產物制品和對照BSA樣品中晚期氧化蛋白產物的濃度，以氯胺-T為標準品，實際測定的為晚期氧化蛋白產物對氯胺-T的相對濃度;Bradford法于595 nm處測定晚期氧化蛋白產物制品和對照BSA樣品中總蛋白的量 (g/L);應用凝膠法鱟試劑 (靈敏度0.25 EU/mL)定性檢測晚期氧化蛋白產物制品中內毒素的量。

1.3.3 THP-1源性巨噬細胞的誘導分化和分組用10%FBS的RPMI1640培養液常規培養THP-1細胞，以160 nmol/L的PMA刺激THP-1細胞24 h［15］后使之分化為巨噬細胞。以100 mg/L的晚期氧化蛋白產物與人巨噬細胞共同培養，復方黃甘提取物不同質量濃度干預處理。

1.3.4 細胞活性的測定 用MTT還原法測定細胞活性。人巨噬細胞以5×104個細胞/mL密度接種到96孔板內，每孔100μL，與晚期氧化蛋白產物共同培養24 h，再加入復方黃甘提取物繼續培養24 h，培養結束后加入MTT 20μL/孔，繼續培養4 h后棄上清，加入DMSO溶液150μL/孔，室溫震蕩10 min，于多功能酶標儀570 nm處測定吸光度OD值。

1.3.5 NO的測定 以100 mg/L的1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產物與人巨噬細胞共同培養于96孔板中24 h，每孔1×106個細胞，復方黃甘提取物不同質量濃度 (100、200、400 mg/L)繼續培養24 h，用Griess試劑法測定培養上清亞硝酸鹽的量，間接反映NO的產生量即取培養上清液100 μL，加入等量 Griess試劑 (1% 對氨基苯磺酸，0.1%N-萘基乙二胺，2.5% 磷酸溶液)，室溫反應10 min，于550 nm處測OD，以NaNO2為標準品繪制標準曲線。

1.3.6 iNOSmRNA表達水平的測定 以100 mg/L的1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產物與人巨噬細胞共同培養于6孔板中24 h，復方黃甘提取物不同質量濃度 (400 mg/L)繼續培養24 h，RT-PCR測定iNOSmRNA的表達水平。iNOS引物序列:上游引 物 5'-CCAAGAGAAGAGAGATTCCATTGAA-3'，下游引物5'-TGATTTTCCTGTCTCTGTCGCA-3';βactin引物序列:上游引物5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3'，下 游 引 物 5'-CATGAGGTAGTCAGTCAGG-3'。

1.3.7 細胞內活性氧 (ROS)的測定 以100 mg/L的1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產物與人巨噬細胞共同培養24 h，復方黃甘提取物不同質量濃度(100，200，400 mg/L)繼續培養24 h，培養結束后用對ROS敏感的熒光探針DCFH-DA標記細胞，用多功能酶標儀在λex=485 nm、λem=535 nm下測定細胞經不同刺激后細胞內氧化DCFH產生的熒光量，即細胞內活性氧的產生量。

1.3.8 抑制劑的阻斷實驗 用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽 (PDTC，10μmol/L)、NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘 (DPI，100μmol/L)和復方黃甘提取物 (400 mg/L)分別預處理細胞1 h，再用晚期氧化蛋白產物刺激，24 h培養結束后用熒光探針DCFH-DA標記細胞，測定細胞內活性氧的產生量;培養上清用ELISA法測定TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量;RT-PCR測定TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達水平。TNF-α基因引物序列 (上游5'-TGGAGAAGGGTGACCGACTC-3'，下 游 5'-TCCTCACAGGGCAATGATCC-3');IL-1β基因引物序列 (上游 5'-CTGTACGATCACTGAACTGC-3'，下游 5-CACCACTTGTTGCTCCATACT-3');IL-6基因引物序列(上游 5'-GGTACATCCTCGACGGCATC-3'，下游 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3')。

2 結果

2.1 晚期氧化蛋白產物制品的測定 1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產物制品及未修飾的BSA中的晚期氧化蛋白產物的量分別為1 047.76μmol/L，20.58μmol/L，其制品與未修飾的BSA的水平比較有顯著性差異 (P＜0.01)，說明晚期氧化蛋白產物制備成功;晚期氧化蛋白產物蛋白質量濃度為12.04 g/L，而且該制品及未修飾的BSA的細菌內毒素水平均低于0.25 EU/mL。

2.2 THP-1源性巨噬細胞的誘導分化 THP-1單核細胞株經160 nmol/L PMA刺激誘導分化24 h后，其細胞形態由原來的懸浮生長，呈球狀，胞漿透澈轉變為THP-1源性巨噬細胞，呈貼壁生長，橢圓狀或梭形，部分伸出偽足，胞漿內有顆粒狀物質，表明THP-1源性巨噬細胞誘導成功。

2.3 細胞活性的測定 將復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h后用MTT法測定其細胞活性，結果顯示復方黃甘提取物在10～500 mg/L質量濃度范圍內對人巨噬細胞的活性無顯著影響(P＞0.05)，見圖1。

2.4 復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h對人巨噬細胞產生NO的影響 巨噬細胞產生的NO是殺滅病原微生物和腫瘤細胞的一道初級防線，可以誘導人巨噬細胞的凋亡。為了研究復方黃甘對晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞產生NO的影響，將復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h，測定其培養上清NO的產生量。圖2顯示晚期氧化蛋白產物抑制人巨噬細胞產生NO(P＜0.05)，給予復方黃甘提取物處理后可顯著性誘導NO的產生 (P＜0.01)，且隨質量濃度的增加而增加。

圖1 復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h對人巨噬細胞的活性影響 (n=6，±s)Fig.1 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the cell viability in macrophages(n=6，±s)

圖2 復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h對人巨噬細胞產生NO的影響 (n=6，±s)Fig.2 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the NO level in macrophages(n=6，±s)

2.5 復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h對人巨噬細胞產生ROS的影響 復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h，測定ROS的產生量。圖3顯示復方黃甘提取物可顯著性抑制晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞產生ROS(P＜0.01)，其抑制程度呈質量濃度依賴性。

圖3 復方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產物共培養24 h對人巨噬細胞產生ROS的影響 (n=6，±s)Fig.3 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the reactive oxygen level in macrophages(n=6，±s)

2.6 抑制劑預處理人巨噬細胞對其活性氧及細胞因子的影響 用NF-κB抑制劑PDTC、NADPH氧化酶抑制劑DPI和復方黃甘提取物預處理細胞1 h，再用晚期氧化蛋白產物刺激，24 h培養結束后測定活性氧量的變化，圖4A顯示兩種抑制劑均能顯著性抑制晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞ROS的產生 (P＜0.01)，復方黃甘提取物也能顯著性抑制ROS的產生 (P＜0.01)，抑制程度弱于DPI和PDTC抑制劑;圖4B～4D ELISA法顯示3種物質均能顯著性抑制TNF-α、IL-1β和IL-6 3種細胞因子的蛋白表達，復方黃甘提取物的抑制程度稍弱。圖5考察了復方黃甘提取物對晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞產生ROS的時間質量濃度依賴性。結果表明當用復方黃甘提取物 (100～400 mg/L范圍)預處理時間為0.5 h時，其抑制ROS的程度在200 mg/L達到平臺期;當預處理時間為1 h時，其抑制ROS的程度呈現一定的質量濃度依賴性。

圖4 DPI、PDTC和復方黃甘提取物對晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞ROS(A)(n=6)、TNF-α蛋白 (B)(n=3)、IL-1β蛋白 (C)(n=3)、IL-6蛋白 (D)(n=3)的影響(±s)Fig.4 Effect of DPI，PDTC，Compound Huanggan Extract on advanced oxidation protein products-induced ROS(A)(n=6)and TNF-α (B)(n=3)，IL-1β (C)(n=3)and IL-6(D)(n=3)secretion in THP-1 macrophages(±s)

圖5 復方黃甘提取物預處理不同時間對晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞 ROS產生的影響 (n=6，±s)Fig.5 Effect of Compound Huanggan Extract by different pre-treatment time on advanced oxidation protein products-induced ROS production in THP-1 macrophages(n=6，±s)

2.7 RT-PCR測定復方黃甘提取物對人巨噬細胞iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平的影響 圖6A顯示復方黃甘提取物可顯著性上調晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞iNOS mRNA的表達水平。圖6B～6D表明可顯著性下調晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達水平，其結果與ELISA法測定的蛋白水平一致。

3 討論

圖6 復方黃甘提取物對晚期氧化蛋白產物誘導人巨噬細胞iNOS m RNA(A)、TNF-αmRNA(B)、IL-1β m RNA(C)、IL-6 mRNA(D)表達的影響(n=3，±s)Fig.6 Effect of Compound Huanggan Extract on advanced oxidation protein products-induced iNOS mRNA(A)，TNF-α m RNA(B)，IL-1β mRNA(C)and IL-6 mRNA(D)in THP-1 macrophages(n=3，±s)

晚期氧化蛋白產物是一種炎癥介質，單核/巨噬細胞是其選擇性作用的靶細胞。本實驗研究發現復方黃甘提取物能夠顯著性增加晚期氧化蛋白產物誘導巨噬細胞分泌NO且呈一定的質量濃度依賴性，是通過上調誘導型一氧化氮合酶的表達而達到的。復方黃甘提取物激活了NO介導的抗增殖效應，抑制巨噬細胞在病灶處的增殖和聚焦，從而減輕病灶局部的微炎癥反應。RT-PCR法和ELISA法均表明復方黃甘提取物可以下調晚期氧化蛋白產物誘導巨噬細胞產生的細胞因子 TNF-α、IL-1β和IL6，進一步減輕了炎癥反應。晚期氧化蛋白產物不僅是次氯酸氧化白蛋白的產物，即氧化應激介導蛋白損傷的標志物，又進一步激活巨噬細胞產生活性氧，形成氧化應激的惡性循環。給予復方黃甘提取物處理后，其能顯著性抑制晚期氧化蛋白產物誘導巨噬細胞產生ROS的水平，且呈一定的質量濃度依賴性，說明復方黃甘提取物能消除已產生的ROS;當用復方黃甘提取物預處理巨噬細胞后，ROS的水平也顯著性降低，其降低程度稍弱于NADPH氧化酶抑制劑DPI和NF-κB抑制劑PDTC。由此可以推測復方黃甘提取物能夠直接消除ROS，也可能通過抑制NADPH酶的活性，或者阻斷NF-κB信號通道來達到消除ROS，從而減輕氧化應激損傷。進一步提出復方黃甘提取物可能通過減輕氧化應激損傷和改善免疫功能紊亂來延緩慢性腎衰的進程。但復方黃甘提取物影響ROS產生的機制還有待進一步實驗探討。

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