10-羥基喜樹堿緩釋微膠囊的組織分布學(xué)研究

楊玉煥， 邵長敏， 駱沙曼， 郭宏紅， 鄭 健， 王 洋

(東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040)

喜樹Camptotheca acuminata Descne是我國特有的多年生亞熱帶落葉闊葉樹種［1］，其次生代謝產(chǎn)物喜樹堿 (camptothecin，CPT)具有良好的抗腫瘤活性［2］。10-羥基喜樹堿 (10-hydroxycamptothecin，HCPT)是將喜樹堿基本環(huán)A環(huán)中10位的-H由-OH取代合成。體外和動物實驗中顯示HCPT比CPT有更強的抗腫瘤作用［3-5］，但是其毒副作用較大，在水中的溶解度極小，使得其臨床應(yīng)用受到一定的限制。基于以上兩點，可將HCPT做成緩控釋制劑來降低藥物的不良反應(yīng)。目前對HCPT研究較多的劑型是納米粒。雖然納米?？梢赃_(dá)到使HCPT緩慢釋放的效果，但是載藥量均低于10%［6］。

課題組前期以氯化鐵 (Fe3+)和硫酸葡聚糖鈉 (DS)為囊壁材料，采用聚電解質(zhì)靜電吸引層層自組裝 (layer-by-layer self assembly，LbL)的方法制備了獨特的HCPT緩釋微膠囊 ［HCPT(Fe3+/DS)n］，體外釋放實驗結(jié)果和小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗結(jié)果表明，這種微膠囊載藥系統(tǒng)與已有HCPT載藥系統(tǒng)相比具有囊壁厚度小、包封率和載藥量高、藥物釋放速度可控、水分散性優(yōu)良等優(yōu)點，是一種很有前景的藥物緩釋載體系統(tǒng)［7-8］。與注射給藥相比，口服給藥途徑比較方便且病人的依從性比較高［9］，因而本研究以昆明小鼠為對象，研究了灌胃給藥后的HCPT(Fe3+/DS)n組織分布特點，結(jié)合前期血漿藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)［7］，初步闡明了HCPT(Fe3+/DS)n的體內(nèi)代謝基本規(guī)律，為HCPT(Fe3+/DS)n進一步組織靶向的深入研究提供基礎(chǔ)，同時為更好地判斷該載藥系統(tǒng)的臨床研究價值提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試藥 HCPT(批號:081020，純度:99%)、CPT(批號:080510，純度:99%)購自哈爾濱峰源高科技開發(fā)有限公司，甲醇、乙腈 (Sigma公司)，超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜系統(tǒng) (Waters，USA);依利特Hypersil ODS2 C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm，遼寧省大連伊利特公司);WH—861漩渦混合器 (江蘇省太倉市科教器材廠);Sorvall Legend Micro 17離心機 (Thermo，USA)。

1.3 實驗動物 雄性小鼠 (ICR級)，體質(zhì)量(20～25)g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供 ［SCXK(吉)2007-2003］。

2 方法與結(jié)果

2.1 HCPT(Fe/DS)n的制備 HCPT(Fe3+/DS)n的制備參照Guo等［7］的方法，分別制備具有4、7和10個 Fe3+/DS雙層的 HCPT(Fe3+/DS)4、HCPT(Fe3+/DS)7和HCPT(Fe3+/DS)10。

2.2 色譜條件 Hypersil ODS2 C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流動相為水 (A)-乙腈(B)=80∶20;體積流量1.2 mL/min;檢測器激發(fā)波長為383 nm，發(fā)射波長553 nm。

2.3 組織分布研究 給藥前小鼠禁食不禁水12 h，按照80 mg/kg HCPT的劑量分別灌胃HCPT或不同層數(shù)的HCPT(Fe3+/DS)n。給藥后于10 min、20 min、40 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h(每個時間點為3只小鼠)，處死小鼠 (脫臼法)，然后取出心、肝、脾、肺、腎、腦，用氯化鈉溶液清洗表面血跡，濾紙吸盡水分，放入－20℃冰柜中保存。測定前取出組織樣本，解凍，稱重，加入一定量的PBS緩沖液 (質(zhì)量體積比為1/2，pH 7.4)，使用十字研磨器研磨成勻漿，置－20℃冰柜冷凍保存。

2.4 生物樣品的制備［10-13］取100μL組織勻漿，加入內(nèi)標(biāo)CPT溶液 (200 ng/mL)100μL，加入乙腈500μL，渦旋3 min蛋白沉淀。然后于高速離心機中12 000 r/min離心10 min，取上清液50μL進樣。

2.5 RP-HPLC法測定各組織中HCPT的分析方法的驗證

2.5.1 方法專屬性 取空白組織勻漿、含HCPT標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo) (CPT)的組織勻漿及給藥后加入內(nèi)標(biāo) (CPT)的組織勻漿按2.4項下方法操作，照2.2項下色譜條件注入色譜儀，并記錄色譜圖，圖1給出了肝組織勻漿的代表性色譜圖。結(jié)果顯示，在HCPT和CPT的保留時間上沒有內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖1 肝組織勻漿色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of liver homogenate

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以測得的藥物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積對組織勻漿藥物濃度進行加權(quán)回歸［14］，構(gòu)建 HCPT標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 (表1)，線性范圍為2.5～80 ng/mL。結(jié)果顯示，在線性范圍內(nèi)，各個組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有良好的線性關(guān)系 (R2＞0.993)。樣品檢測時，對于質(zhì)量濃度超出線性范圍的樣品，用空白組織勻漿為基質(zhì)適當(dāng)稀釋后再進行檢測。

表1 小鼠各組織樣品典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Tapical linear regression equations in different tissues

2.5.3 精密度 分別配制低、中、高3個質(zhì)量濃度的HCPT質(zhì)量控制 (QC)樣品，按2.4項下方法制備樣品，分別在同日內(nèi)不同時間測定分析6次，計算日內(nèi)精密度;連續(xù)5 d中同一時間點測定1次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HCPT的質(zhì)量濃度，計算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)精密度在89.82%～109.41%之間，RSD% ＜10.83%;日間精密度在89.82% ～106.73%之間，RSD% ＜10.03%。

2.5.4 萃取回收率 低、中、高質(zhì)量濃度QC樣品按2.4項下方法制備樣品，每個質(zhì)量濃度重復(fù)測定6次，其結(jié)果與未經(jīng)提取的HCPT/CPT進樣檢測獲得的峰面積比值進行比較，得到萃取回收率。結(jié)果表明，平均萃取回收率為87.17%～117.69%，RSD為1.64% ～8.36%。

2.6 HCPT的組織分布 灌胃給藥后，HCPT及HCPT(Fe3+/DS)n在肝、腎、脾、肺組織各個時間點均有不同程度的檢出，而HCPT及HCPT(Fe3+/DS)n在心臟組織中的量均低于檢測極限，在腦組織中只有HCPT(Fe3+/DS)10給藥后有少量檢出。根據(jù)檢測結(jié)果繪制的小鼠灌胃給藥HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n后，HCPT在各個組織 (肝、腎、肺、脾、腦)中的藥時曲線 (圖2)。

圖2 小鼠灌胃給藥HCPT(Fe3+/DS)n后各組織中HCPT質(zhì)量濃度與時間關(guān)系曲線Fig.2 Concentration-tim e curve of HCPT after adm inistration in different tissues

與 HCPT相比，HCPT(Fe3+/DS)n給藥后，HCPT在肝組織中的藥物質(zhì)量濃度更高，說明HCPT(Fe3+/DS)n在肝組織中有更強的靶向蓄積效果 (圖2A)。HCPT與 HCPT(Fe3+/DS)4給藥組腎組織中的HCPT質(zhì)量濃度沒有明顯的差別，而HCPT(Fe3+/DS)7和HCPT(Fe3+/DS)10給藥后，HCPT在小鼠腎組織中的積累增加 (圖2B)。從圖2C中可以看出，小鼠灌胃給藥 HCPT和 HCPT(Fe3+/DS)4后，HCPT在肺中的量一直很低，而HCPT(Fe3+/DS)7和HCPT(Fe3+/DS)10給藥后，在4個小時之內(nèi)肺組織中HCPT的質(zhì)量濃度很高，HCPT(Fe3+/DS)10給藥后，HCPT釋放的速度更慢，表現(xiàn)出更強的緩釋效果。從圖2D中可以看出，與HCPT直接給藥組比較，小鼠灌胃給藥HCPT(Fe3+/DS)n后脾組織中HCPT質(zhì)量濃度更高，說明HCPT(Fe3+/DS)n給藥有利于加強藥物在脾組織中的吸收。HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n給藥后，除了HCPT(Fe3+/DS)10給藥組以外，其他給藥組腦組織樣品中均檢測不到藥物的存在，說明HCPT(Fe3+/DS)10增強了 HCPT在腦中的吸收，更有利于藥物突破血腦屏障 (圖2E)。

根據(jù)藥-時數(shù)據(jù)計算HCPT在各組織中的藥時曲線下面積 (AUC0－∞)，比較不同組織中AUC0－∞值的變化 (圖3)。

圖3 單劑量灌胃HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n小鼠各個組織中藥時曲線下的面積Fig.3 AUC0－∞ after a single oral dose of 80mg/kg in different tissues of mice

結(jié)果表明藥物在各個組織中從高到低分布的順序為肝、腎、肺、脾、腦，而心臟組織中未檢出。HCPT(Fe3+/DS)10給藥組在肝、腎組織中HCPT的積累接近HCPT直接給藥且顯著低于HCPT(Fe3+/DS)4和HCPT(Fe3+/DS)7給藥組，而相對于其他給藥組藥物在肺、脾、腦組織中的積累則顯著提高。在同一組織中，與HCPT直接給藥相比較，HCPT(Fe3+/DS)n給藥后HCPT的量更高。在肺、脾、腦組織中隨著微膠囊層數(shù)的增多，組織中HCPT的量增加。

3 討論

課題組利用 Fe3+和 DS為囊壁材料制備的HCPT(Fe3+/DS)n，微膠囊?guī)в斜容^強的負(fù)電荷(－40 mV)，粒徑大小在5～10μm。小鼠灌胃給藥后的藥代動力學(xué)研究顯示，與HCPT直接給藥相比，HCPT(Fe3+/DS)n給藥后，半衰期由9.03 h延長到 25.39 h［HCPT(Fe3+/DS)7］和 30.42h［HCPT(Fe3+/DS)10］，這說明，HCPT從微膠囊中緩慢釋放出來，從而延長了HCPT在血液中的滯留時間，提高了HCPT在體內(nèi)的穩(wěn)定性，起到了一定的緩釋效果。另一方面，HCPT(Fe3+/DS)n給藥后，其AUC0－∞分別提高了90% ［HCPT(Fe3+/DS)7］和96.5% ［HCPT(Fe3+/DS)10］，顯著提高了HCPT的生物利用度，且與HCPT直接給藥相比，HCPT(Fe3+/DS)n給藥后，AUC0–24與AUC0－∞的比值有所降低，這說明，在給藥后24 h內(nèi)，HCPT(Fe3+/DS)n的降解速率較HCPT直接給藥慢，這也在一定程度上顯示了HCPT(Fe3+/DS)n的緩釋效果。這與體外釋放的結(jié)果是一致的，在前8個小時，微膠囊對HCPT起到了明顯的緩釋效果，其半衰期從0.38 h延長至1.6 h。經(jīng)灌胃給藥后，藥物在胃腸道內(nèi)緩慢的從微膠囊中釋放出來被腸道吸收，進而起到了藥物在動物體內(nèi)緩慢釋放的效果［7］。

本研究在此基礎(chǔ)上進一步考察了HCPT(Fe3+/DS)n的組織分布特征。實驗結(jié)果顯示HCPT(Fe3+/DS)n給藥后改變了HCPT在小鼠組織中的分布，其中肝臟的蓄積明顯增強，HCPT(Fe3+/DS)4更有利于肝和腎組織中藥物質(zhì)量濃度的積累。在肺、脾、腦組織中隨著微膠囊層數(shù)的增多HCPT在組織中的蓄積質(zhì)量濃度增高。HCPT和HCPT(Fe3+/DS)n在心臟中均未檢測出，說明HCPT在心臟中的分布較低，低于本實驗的檢測限。在腦組織中，HCPT直接給藥與4～7個雙層的HCPT微膠囊給藥均未檢測出HCPT，而在給藥10個雙層的HCPT微膠囊后，有少量的HCPT被檢測出，這可能是因為Fe3+－DS形成的多聚物有利于沖破血腦屏障，有利于藥物進入腦部，這說明為了提高腦腫瘤的治療效果，增加HCPT(Fe3+/DS)n囊壁層數(shù)有利于藥物吸收。

綜合體外釋放實驗結(jié)果［7］，體內(nèi)藥代動力學(xué)和組織分布的研究結(jié)果表明，HCPT(Fe3+/DS)n具有良好的緩釋效果，可有效地提高HCPT體內(nèi)的吸收和分布，具有進一步深入研究的價值。

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