響應面法優化藥對柴胡—黃芩的揮發油提取工藝及其化學成分GC-MS分析

羅 蘭， 管淑玉

(廣東藥學院中藥學院，廣東廣州510006)

藥對是臨床上常用的配伍形式，雖然組成相對簡單，但它具有中藥配伍的基本特點［1］。藥對配伍的研究是復方配伍規律研究的基礎和重要切入點之一，了解兩藥配伍后的化學成分變化，有利于剖析和闡明復方中藥的配伍機理［2-4］。藥對柴胡—黃芩是《傷寒論》柴胡類方中最具代表意義的基本配伍，具有疏肝解郁、清肝泄膽的功效，現代臨床將它作為清泄肝膽的經典藥對倍加推崇，用于肝郁氣滯所致的痞積腫塊等癥，療效顯著。目前關于藥對柴胡—黃芩配伍的研究多集中在藥理作用［5-10］方面，而關于該藥對配伍的化學成分報道甚少。本實驗采用Box-Behnken設計原理和響應面法［11-15］確定水蒸汽蒸餾法提取藥對揮發油的最佳工藝條件，利用GC-MS分析藥對柴胡—黃芩配伍前后的揮發油成分，從而為闡釋藥對柴胡—黃芩的物質基礎內涵提供實驗依據。

1 儀器與材料

安捷倫7890A-5970C氣質聯用儀;BP211D精密天平 (德國賽多利斯);揮發油提取器;粉碎機FZ102(北京中興偉業儀器有限公司)。

柴胡為北柴胡Bupleurum chinense DC．的干燥根 (購自廣州致信中藥飲片有限公司);黃芩為黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根 (購自廣州致信中藥飲片有限公司)。以上藥材均經廣東藥學院中藥資源系李書淵教授鑒定。藥對柴胡黃芩按1∶1的劑量混合。

2 方法與結果

2.1 藥對柴胡黃芩揮發油的提取方法 根據《中國藥典》2010版一部附錄XD，采用水蒸汽蒸餾法進行揮發油提取。

分別將柴胡、黃芩藥材粉碎過篩，精密稱取柴胡、黃芩藥材粉末各50 g，置于同一圓底燒瓶中，加入相應倍數的水振搖混勻，浸泡，加入玻璃珠數粒，緩緩加熱至沸，并保持微沸至規定時間，停止加熱，放置至冷卻，接收揮發油，無水硫酸鈉除去揮發油中水分，精密測定揮發油體積，計算揮發油得率。

2.2 單因素試驗 以揮發油得率為考察指標，采用單因素法考察提取時間、液料比、藥材粒度、浸泡時間等因素對揮發油提取率的影響。

2.2.1 提取時間對揮發油得率的影響 按2.1項下的方法提取揮發油，固定液料比 (8倍)、藥材粒度 (40目)、浸泡時間 (60 min)，考察不同提取時間 (4、6、8、10、12 h)對揮發油得率的影響，每個實驗重復3次。結果見圖1。

圖1 不同提取時間對揮發油得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of volatile oil

由圖1可知，提取時間在4～8 h范圍內，揮發油得率隨著提取時間的增加而迅速提高。但在8 h后，隨著提取時間的增加，揮發油得率變化很小。

2.2.2 液料比對揮發油得率的影響 按2.1項下的方法提取揮發油，固定提取時間 (8 h)、藥材粒度 (40目)、浸泡時間 (60 min)，考察不同液料比 (4、6、8、10、12倍)對揮發油得率的影響，每個實驗重復3次。結果見圖2。

圖2 不同液料比對揮發油得率的影響Fig.2 Effect of solvent/sample ratio on extraction rate of volatile oil

由圖2可知，液料比在4～8倍范圍內，揮發油得率隨著液料比的增加而迅速提高。但在8倍以后，隨著液料比的增加，揮發油得率變化很小。

2.2.3 藥材粒度對揮發油得率的影響 按2.1項下的方法提取揮發油，固定提取時間 (8 h)、液料比 (8倍)、浸泡時間 (60 min)，考察藥材不同粒度 (10、20、40、60、80目)對揮發油得率的影響，每個實驗重復3次。結果見圖3。

圖3 藥材不同粒度比對揮發油得率的影響Fig.3 Effect of different particle sizes on extraction rate of volatile oil

由圖3可知，藥材粒度在10～40目范圍內，揮發油得率隨著藥材粉末目數的增加而迅速提高。但在40目以后，隨著目數的增加，揮發油得率變化很小。

2.2.4 浸泡時間對揮發油得率的影響 按2.1項下的方法提取揮發油，固定提取時間 (8 h)、液料比 (8倍)、藥材粒度 (40目)，考察不同浸泡時間 (15、30、60、90、120 min)對揮發油得率的影響，每個實驗重復3次。結果見圖4。

由圖4可知，浸泡時間在15～60 min范圍內，揮發油得率隨著浸泡時間的增加而提高，但在60 min以后，隨著浸泡時間的增加，揮發油得率變化很小。

2.3 響應面分析試驗

圖4 不同浸泡時間比對揮發油得率的影響Fig.4 Effect of different soak time on extraction rate of volatile oil

2.3.1 響應面實驗設計及實驗結果 根據Box-Behnken設計原理和單因素試驗結果，以提取時間、液料比、藥材粒度三個因素為自變量，揮發油得率為響應值，進行三因素三水平17個實驗點的響應面分析試驗，其中12個為析因實驗，5個為中心實驗。因素水平見表1，實驗結果見表2。

表1 響應面分析試驗的因素與水平Tab.1 Vairables and levels in response surface methodology experimental design

表2 響應面分析實驗結果Tab.2 Results of response surface methodology experim ental design

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗 利用軟件Design-Expert 7.0對實驗結果進行多元回歸擬合分析，得到揮發油得率與各因素變量的二次方程模型為 Y (%) = －0.501 15+ 0.058 462 A+0.077 775 B+0.004 501 25 C－6.25×10－5AB－1.25×10－5AC－6.25×10－6BC －2.962 5×10－3A2－4.65×10－3B2－5.587 5×10－5C2。對回歸方程進行顯著性檢驗，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析結果Tab.3 Analytic results of variance

由表3可知，提取時間和液料比的一次項均達到極顯著性水平，二次項對揮發油提取的曲面效應極顯著，交互項交互效應不顯著，表明各影響因素對揮發油得率的影響是簡單的線性關系。該二次方程模型達到極顯著水平，模型的相關系數r=(8.107×10－3/8.210×10－3)×100%=98.75%，說明響應值的變化有98.75%來源于所選變量，可以用此模型對揮發油的提取效果進行分析。失擬項F值為0.41，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著，而不顯著的失擬項才是可取的，說明該回歸方程對試驗擬合情況較好，該模型能夠較好的描述實驗結果。

2.3.3 響應面分析 響應面圖形是響應值對因素A、B、C所構成的三維空間曲面圖，從響應面圖上可形象地看出各參數之間的相互作用。結果見圖5～7。

從圖5～7的等高線形狀可看出，提取時間、液料比和藥材粒度相互之間的交互作用不顯著。圖5中沿A軸的等高線密度變化相對沿B軸的變化較大，說明提取時間對揮發油得率的影響比液料比大;圖6中A軸的等高線密度變化相對沿C軸的變化較大，說明提取時間對揮發油得率的影響比藥材粒度大。

圖5 提取時間、液料比對揮發油得率交互影響的三維響應面圖Fig.5 3D response surface p lot of extraction time，solvent/sam p le ratio and their m utual interactions on the yield of volatile oil

圖6 提取時間、藥材粒度對揮發油得率交互影響的三維響應面圖Fig.6 3D response surface p lot of extraction tim e，particle sizes and their mutual interactions on the yield of volatile oil

2.3.4 提取條件優化 根據軟件Design-Expert 7.0分析，藥對揮發油的最佳提取工藝條件為提取時間9.7 h，液料比8.27倍，藥材粒度38.72目，藥對揮發油得率的理論值可達0.191%。為方便實驗操作，將最佳提取工藝條件中的藥材粒度修正為40目，實際測得的揮發油得率為0.189%，RSD為1.05%，與理論值相符，所以基于響應面法優化的提取工藝條件準確可靠。

圖7 液料比、藥材粒度對揮發油得率交互影響的三維響應面圖Fig.7 3D response surface plot of solvent/sample ratio，particle sizes and their mutual interactions on the yield of volatile oil

2.4 藥對柴胡—黃芩及各單味藥材的揮發油成分GC-MS分析

2.4.1 GC-MS分析條件 DB-5MS毛細管柱 (60 m×0.32 mm，0.25μm);載氣為He;進樣口溫度為280℃;程序升溫40℃，保持5 min，2℃/min升溫至240℃，保持10 min，4℃/min升溫至280℃，保持10 min;離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃;譜庫為wiely7n.l。

2.4.2 樣品溶液的制備 按照最佳提取工藝條件，并按2.1項下的揮發油提取方法，分別提取藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發油，再分別精密吸取揮發油1 mL，置于100 mL量瓶中，并用乙酸乙酯稀釋至刻度，混勻，即得3個樣品溶液。

2.4.3 GC-MS分析結果 吸取上述3個樣品溶液各1μL，進行GC-MS分析，按照面積歸一化法計算相對含有量。總離子流圖見圖8，化學成分分析結果見表4。

由表4可知，從藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發油中分別鑒定了116個組分、85個組分和43個組分，分別占其揮發油總量的90.23%、91.02%和92.01%。藥對揮發油主要含有脂肪酸、烷烴、萜類和芳香族化合物，在成分種類上幾乎是單味藥材柴胡、黃芩二者的加和，且主要來自于柴胡，表明柴胡在藥對揮發油成分中占主導地位。藥對揮發油中含有量較高的成分有棕櫚酸(13.75%)、苯乙酮 (8.76%)、糠醛 (4.33%)、芥酸酰胺 (4.20%)、庚醛 (3.08%)亞油酸(2.37%)、壬酸 (2.31%)等。

圖8 藥對柴胡黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發油GC-MS總離子流圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram s of the volatile oil from Bupleurum chinense，Scutellaria b aicalensis，and their herbal pair

3 討論

響應面法是通過對響應面等值線的分析尋求最優工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系的一種統計方法。與正交實驗相比，其優勢是:在實驗條件尋優過程中，可以連續的對實驗的各個水平進行分析，而正交實驗只能對一個個孤立的實驗點進行分析。但是響應面法仍有其局限性，該方法的前提是設計的實驗點應包括最佳的實驗條件。本實驗采用響應面法得到揮發油得率與各因素變量的二次方程模型，該二次方程模型達到極顯著水平，模型的相關系數為98.75%，該回歸方程對試驗擬合情況較好，并確定了藥對揮發油的最佳提取工藝條件為提取時間9.7 h，液料比8.27倍，藥材粒度40目。

本實驗采用GC-MS對藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩的揮發油成分進行分析，結果表明藥對揮發油在成分種類上幾乎是單味柴胡、黃芩二者的加和，且主要來自于柴胡，說明柴胡在藥對揮發油成分中占主導地位。

表4 藥對柴胡—黃芩及單味藥材柴胡、黃芩揮發油的化學成分Tab.4 Chem ical com positions of volatile oil from Bupleurum chinense，Scutellaria baicalensis，and their herbal pair

續表4

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