巴特日七味丸中大葉茜草素與硫化汞的測定

許曉潔， 王 偉， 王玉華*

(1．內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特010110;2．內蒙古自治區食品藥品檢驗所，內蒙古呼和浩特010020)

蒙成藥“巴特日七味丸”收載在《中華人民共和國衛生部藥品標準》［1］(蒙藥分冊)第79頁，處方由草烏葉、訶子、茜草、多葉棘豆、黑蕓香、人工麝香、銀朱等七味藥材組成。在對巴特日七味丸質量控制方法的研究過程中，參照《中國藥典》2010年版［2］制草烏項下方法對草烏葉中雙酯型生物堿的測定方法進行了研究，因生物堿的量太低，未能建立定量測定方法;參考文獻報道［3］，采用HPLC法對訶子進行定量測定方法的研究，因共存成分的干擾大，未能建立測定方法;黑蕓香是蒙醫用藥材，缺少化學成分的研究工作基礎。本實驗用HPLC法測定了茜草中大葉茜草素的量;用容量法測定了銀朱中HgS的量。本研究對巴特日七味丸的質量控制具有意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 雙光束紫外可見分光光度計TU—1901(上海精科實驗有限公司);高效液相色譜儀P230(大連伊利特分析儀器有限公司);電子天平AL204(梅特勒-托利多儀器有限公司);超聲清洗儀AS3120(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 巴特日七味丸 (內蒙古蒙藥股份有限公司，批號100619;內蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號090401、091114、100416;內蒙古庫倫蒙藥廠，批號100804;內蒙古大唐藥業有限公司，批號10454007、10454009)。

大葉茜草素對照品 (由中國藥品生物制品檢定所購入，批號為110884-200604);銀朱 (由烏蘭浩特中蒙制藥有限公司提供);甲醇為色譜純，水為高純水，所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜法測定大葉茜草素［4-5］茜草是巴特日七味丸的主要藥味之一。茜草的主要化學成分為大葉茜草素、羥基茜草素等。本實驗采用反相高效液相色譜法對大葉茜草素的測定方法進行了研究。經實驗研究確定了提取條件和液相分離條件，并對HPLC法進行了方法學考察。該方法專屬性和準確性好，可以作為巴特日七味丸質量控制的方法。

2.1.1 色譜條件 C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水 (85∶15);體積流量為1.0 mL/min;檢測波長為250 nm，進樣體積為20 μL。理論塔板數以大葉茜草素峰計算不低于4 000。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 供試品溶液的制備 依據《中國藥典》2010年版“茜草”項下的含量測定方法，在此基礎上進行單因素篩選確定了供試品溶液的制備方法。

取本品粉末約4.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質量，暗處放置5～8 h，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液50 mL，蒸干，殘渣加甲醇-25%鹽酸 (4∶1)混合溶液20 mL溶解，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，加入三乙胺3 mL，混勻，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取大葉茜草素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含50μg的溶液，即得。

2.1.2.3 陰性對照溶液的制備 按照處方比例及制備工藝，取缺茜草的6味藥材粉末制備陰性對照品。精密稱取陰性對照品適量，按2.1.2.1項“供試品溶液的制備”方法制成陰性對照溶液。

2.1.3 線性關系考察 精密稱取大葉茜草素對照品，用甲醇溶解并制成每1 mL含有大葉茜草素116.5μg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液適量，加甲醇制成含大葉茜草素質量濃度為 11.65、23.30、34.95、46.60、58.25、69.90、116.5μg/mL等7組系列對照品溶液，分別精密吸取系列對照品溶液20μL，按“色譜條件”項下方法測定，記錄各圖譜的大葉茜草素峰面積積分值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸分析。結果顯示，大葉茜草素在0.233～2.33μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性，回歸方程為 Y=6 300.6X －267.53(r=0.997 8)。

2.1.4 精密度試驗 取本品，按2.1.2.1項方法制備溶液，按2.1.1項下方法測定，記錄色譜峰的積分值。6次測定結果的RSD為0.45%。

取對照品溶液，同法測定并記錄色譜峰的積分值。6次測定結果的RSD為0.95%。

2.1.5 穩定性試驗 取本品，按2.1.2.1項方法制備溶液，按2.1.1項下方法操作，于溶液制備后的0、0.5、1、2、4、6、8、24 h進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液在24 h內穩定。條件:在棕色瓶中避光放置。

2.1.6 重復性試驗 取同一批號供試品 (內蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號:090401)6份，按2.1.2.1項方法制備溶液，按2.1.1項下方法操作，記錄色譜圖，計算其平均質量分數為0.806 mg/g，RSD為2.00%。

2.1.7 專屬性考察 按2.1.2.3項下方法制備溶液，按2.1.1項下方法操作，記錄供試品溶液、陰性對照溶液、大葉茜草素對照品溶液的色譜圖。結果顯示，在對照品色譜峰保留時間對應的位置上，供試品溶液有色譜峰，陰性對照溶液沒有色譜峰，方法的專屬性好，見圖1。

圖1 大葉茜草素專屬性試驗色譜圖Fig.1 Chromatograms of specificity tests of rubimaillin

2.1.8 加樣回收試驗 取已知含有量的巴特日七味丸樣品 (內蒙古烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號為090401，含有量為0.806 mg/g)，稱取9份，每份分別加入一定量大葉茜草素對照品，使之成為80%、100%和120%的加樣回收試驗樣品，按2.1.2.1項方法制備溶液，按2.1.1項下方法操作，記錄色譜圖。加樣回收試驗結果見表1。表1的結果顯示，80%、100%、120%回收試驗結果的均值為99.0%，RSD為1.61%，表明方法的準確度好。

表1 加樣回收試驗結果 (n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.2 銀朱中HgS的測定 礦物藥銀朱在巴特日七味丸的制備過程中，部分入藥，部分用于包衣，投料的比例相對較大。銀朱藥用時主要有安神、消炎、鎮靜催眠功效。銀朱中汞的存在形式除硫化汞外，還有游離汞和可溶性汞鹽。游離汞是0價汞，可溶性汞鹽是指能溶于胃酸的汞鹽。游離汞和可溶性汞鹽經一定的腸道細菌生物轉化后，可能與帶甲基的物質反應形成甲基汞。人對甲基汞的吸收率可高達100%，甲基汞的毒性大［6］。本實驗對銀朱中硫化汞的定量測定方法進行了研究，通過對硫化汞的質量控制使游離汞和可溶性汞鹽的量得到相對控制，保證用藥的安全和有效。本實驗采用硫氰酸銨滴定法測定硫化汞 (HgS)［7-8］。

2.2.1 測定方法 銀朱主含硫化汞 (HgS)。參照《中國藥典》2010年版一部“朱砂”項下的含量測定方法，用硫氰酸銨滴定法測定硫化汞量。

取巴特日七味丸，研細，取約1.5 g，精密稱定，置250 mL凱氏燒瓶中，加硝酸50 mL，凱氏燒瓶上加漏斗，加熱使硝酸呈微沸2 h，放冷，濾過，濾渣及濾紙轉入原凱氏燒瓶中，加硝酸鉀2.0 g，硫酸20 mL，加熱微沸處理30 min，放冷，加硝酸鉀2.0 g，加熱微沸處理30 min使銀朱完全溶解，放冷，轉移至250 mL錐形瓶中，用水50 mL分次洗滌燒瓶，洗液并入溶液中，加1%高錳酸鉀溶液至顯粉紅色，2 min內不退色，再滴加2%硫酸亞鐵溶液至紅色消失后，加硫酸鐵銨指示液2 mL，用硫氰酸銨滴定液 (0.1 moL/L)滴定至溶液顯淺橙黃色，每1 mL硫氰酸銨滴定液相當于11.63 mg的硫化汞。

2.2.2 銀朱藥材的測定 取銀朱藥材3份，各約0.1 g，精密稱定，同上方法進行測定，測得平均含有量為91.75%。

2.2.3 陰性對照試驗 按處方制備陰性對照品(缺銀朱)，稱取2份，每份約1.5 g，同上方法進行測定。結果顯示，滴加半滴硫氰酸銨滴定液(0.1 mol/L)即顯示到達滴定終點，并且試驗現象明顯，說明處方中的其他組分對銀朱的測定沒有干擾。

2.3 樣品測定 取不同廠家、不同批次的供試品，按2.1.2.1項方法制備溶液，按2.1.1項下方法操作，記錄色譜圖，計算巴特日七味丸中大葉茜草素量，按2.2.1項測定7個批次巴特日七味丸中硫化汞的量，測定結果見表2。

表2 樣品測定結果 (n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

結果顯示，不同來源的樣品以及同一來源的不同批次樣品中大葉茜草素的量有變化，在0.530 mg/g～0.819 mg/g之間。巴特日七味丸中含銀朱以硫化汞計，含有量在27.18～45.23 mg/g之間。銀朱藥材含有毒成分游離汞和可溶性汞鹽，通過對硫化汞的定量測定和控制可以使游離汞和可溶性汞鹽得到相對控制。本實驗的研究對巴特日七味丸的安全有效用藥具有意義。

3 討論

3.1 流動相的選擇 按2.1.2.1項下方法制備供試品溶液，對以下3種流動相進行了比較研究［9-10］:甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液 (25 ∶50 ∶25)、甲醇-乙腈-水 (6∶3∶1)和甲醇-水 (85∶15)。結果表明，以甲醇-水 (85∶15)作為流動相時，大葉茜草素峰的保留時間為20.2 min，且與相鄰組分峰分離效果好。

3.2 檢測波長的選擇 在200～800 nm范圍內對大葉茜草素進行光譜掃描，結果顯示，大葉茜草素在218.00、250.00、273.00、281.50、392.00 nm 處有吸收。分別將巴特日七味丸供試品溶液和大葉茜草素對照品溶液20μL注入高效液相色譜儀，對紫外檢測器設定不同檢測波長［11］的情況下，對大葉茜草素峰進行檢測，并計算巴特日七味丸中大葉茜草素的量。結果表明，在250 nm波長處，大葉茜草素量最高，故確定250 nm作為檢測波長，與《中國藥典》2010年版一部茜草項下的檢測波長一致。

3.3 對大葉茜草素和大葉茜草素溶液的穩定性考察 大葉茜草素在常溫不避光的條件下穩定性差，在薄層色譜中可顯示兩個斑點。用HPLC法考察大葉茜草素甲醇溶液的穩定性，常溫不避光條件下的穩定時間約為6 h［12］，避光冷藏，該時間可延長到4倍以上，因此，建議將大葉茜草素對照品及溶液避光冷藏。

3.4 提取溶劑和提取時間的選擇 本實驗采用《中國藥典》2010年版一部的茜草項下的提取方法，即超聲提取。對甲醇、乙醇和80%甲醇作為溶劑的結果進行了比較研究，結果顯示，用甲醇作為溶劑時的提取效率最高。

對超聲時間15、30、45、60 min的結果進行了比較，結果顯示，從15 min到30 min，隨著提取時間的延長，提取效率增加;30 min以后，提取時間的延長使含有量有下降趨勢。故將超聲時間確定為30 min。

3.5 浸泡時間的選擇 本實驗對《中國藥典》2010年一部版茜草含量測定項下的超聲提取前的浸泡時間進行了篩選。設置不同的浸泡時間，考察浸泡時間對測定結果的影響。

結果顯示，浸泡時間在0～5 h范圍內，隨浸泡時間增加，大葉茜草素含有量逐漸增大;浸泡5～8 h之間，大葉茜草素量最高;浸泡時間大于8 h后，大葉茜草素量有下降趨勢，可能與大葉茜草素在甲醇溶液中的穩定性有關，故將浸泡時間規定為5～8 h。

3.6 耐用性試驗 取本品，按2.1.2.1項方法制備溶液，按2.1.1項下方法操作，記錄色譜圖。用兩個型號的色譜柱進行試驗，對其結果進行對比研究，結果見表3。

表3 不同色譜柱的試驗結果Tab.3 Results of different columns

結果顯示，Phenomenex C18柱的峰窄而高，Diamonsil C18柱的峰寬且矮，兩種柱子均能達到與相臨峰的基線分離，按大葉茜草素的峰計算理論塔板數均大于10 000，兩個柱子的測定結果基本一致。故實驗對柱子的型號不做要求。

3.7 峰純度檢查 按2.1.2項下的方法制備供試品溶液和對照品溶液。按2.1.1項下方法操作，僅對流動相比例進行調整，分別用如下的流動相進行洗脫，甲醇-水 (85∶15)、甲醇-水 (80∶20)、甲醇-水 (78∶22)。各流動相的色譜圖顯示，隨著流動相極性增大，大葉茜草素色譜峰的保留時間增加，但供試品溶液的主峰面積沒有出現裂分現象。

進一步用高效液相色譜儀的二極管陣列檢測器對被測成分大葉茜草素的峰進行純度驗證，結果表明，被測供試品溶液中大葉茜草素峰純度為98.49%。

3.8 硝酸加熱溶解時間的考察 為了保證有機破壞過程進行完全，對硝酸用量和加熱溶解時間作了考察。取供試品約1.5 g，加50 mL硝酸，置凱氏燒瓶中，為避免加熱過程中硝酸分解逸出過快，于凱氏燒瓶口處放一漏斗，置電爐上加熱保持微沸，分別對15、30、60、90、120、150、180 min的加熱時間的結果進行觀察和比較。結果顯示，加熱時間從90 min開始，凱氏燒瓶中的棕色煙霧逐漸消失，溶液的顏色逐漸變淺;加熱至120 min時，凱氏燒瓶中的棕色煙霧完全消失，溶液變得幾乎無色透明;加熱時間進一步延長時，觀察的結果與120 min相同。故將加熱時間定為120 min。

3.9 硝酸鉀和硫酸作用時間、次數的考察 為保證被測成分消解完全，對硝酸鉀加入次數及硫酸作用時間進行考察，經反復試驗觀察，結果顯示，加入硫酸20 mL，硝酸鉀2.0 g，加熱微沸處理30 min，放冷，加硝酸鉀2.0 g，加熱微沸處理30 min，放冷，溶液接近無色，即消解完全。

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