金花茶花、種子和葉提取物對(duì)U937和HCT116細(xì)胞增殖抑制的實(shí)驗(yàn)觀察

于大永， 時(shí)貞頌， 史麗穎， 馮寶民， 王永奇

(大連大學(xué)藥物研究所，遼寧大連116622)

金花茶Camellia chrysantha(Hu)Tuyama系山茶科Theaceae山茶屬Camellia植物，集中分布在中國(guó)廣西壯族自治區(qū)的西南部以及廣西壯族自治區(qū)與越南接壤的區(qū)域［1］。金花茶的葉主要用于咽喉炎，痢疾，腎炎，水腫，尿路感染，黃疸性肝炎，肝硬化腹水，高血壓，預(yù)防腫瘤等。金花茶花主要用于便血、月經(jīng)不調(diào)［2-3］。早期金花茶研究熱點(diǎn)主要集中在對(duì)金花茶植物形態(tài)學(xué)、植物分類(lèi)學(xué)等方面的報(bào)道。而近年來(lái)對(duì)金花茶活性及功能因子的研究表明，金花茶具有抗氧化、降血脂、抗肝癌前病變等活性［4-6］。本課題組在以前的研究中報(bào)道了金花茶種子可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖［7］，現(xiàn)在繼續(xù)對(duì)金花茶植物各部位抗腫瘤活性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 金花茶種子的提取 金花茶種子、花和葉采集于廣西南寧，由廣西林業(yè)科學(xué)研究院高級(jí)工程師梁盛業(yè)鑒定。金花茶種子、花和葉用95%乙醇提取并濃縮，得到金花茶種子95%乙醇提取物、葉95%乙醇提取物和花95%乙醇提取物。金花茶葉用蒸餾水提取并濃縮，得到金花茶葉水提取物。實(shí)驗(yàn)前將上述各浸膏用DMSO分別配成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的樣品。然后將各個(gè)樣品用無(wú)血清培養(yǎng)基配成50、100、200、500、1 000、2 000μg/mL的藥物原液，并用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，置4℃冰箱備用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，常規(guī)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)液用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)加入鏈霉素和青霉素，使雙抗在培養(yǎng)液中的濃度為100 U/mL，于37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。視具體情況換培養(yǎng)液，每2～3天傳代培養(yǎng)，使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好，處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，用含有10%熱滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將U937和HCT116細(xì)胞制成懸液并調(diào)密度至1×105/m L，取96孔平底培養(yǎng)板，各孔加入180μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的藥物原液20 μL，實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)藥物質(zhì)量濃度組，每組藥物的終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200μg/mL。其中藥物質(zhì)量濃度為200μg/mL時(shí)含二甲基亞砜 (DMSO)量最高，為0.2%，因此設(shè)空白對(duì)照和含0.2%DMSO對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)3孔。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，孵育24 h，各孔加入MTT溶液 (5 mg/mL)20μL，同樣條件繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)。棄上清液，每孔加入150μL DMSO，(40℃恒溫培養(yǎng)箱中放置使結(jié)晶物充分溶解)。選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值，計(jì)算體外細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(藥物孔OD值/對(duì)照孔OD值) ×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較分析，P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 金花茶花的抗腫瘤活性 用金花茶花95%乙醇提取物處理HCT116細(xì)胞和U937細(xì)胞，結(jié)果 (表1)發(fā)現(xiàn)20 μg/mL金花茶花乙醇提取物對(duì)HCT116細(xì)胞增殖就開(kāi)始有抑制作用，并且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞存活率逐步下降提高，且與對(duì)照組有顯著差異 (P＜0.05或P＜0.01)。金花茶花乙醇提取物從50μg/mL開(kāi)始對(duì)U937細(xì)胞增殖有抑制作用，并且也表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性關(guān)系。另外含0.2%的DMSO的樣品與空白對(duì)照相比沒(méi)有差異 (數(shù)據(jù)未列出)。經(jīng)過(guò)計(jì)算金花茶花95%乙醇提取物抑制HCT116和U937細(xì)胞的IC50分別為48.48μg/mL和211.71μg/mL。

表1 金花茶花95%乙醇提取物對(duì)U937細(xì)胞和HCT116細(xì)胞增殖的影響

2.2 金花茶種子的抗腫瘤活性 考察了不同質(zhì)量濃度金花茶種子95%乙醇提取物對(duì)U937和HCT116細(xì)胞增殖的影響。從表2可以看到5μg/mL金花茶種子乙醇提取物對(duì)U937就開(kāi)始有抑制作用，并且隨著質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，各質(zhì)量濃度組與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。而金花茶種子乙醇提取物抑制HCT116細(xì)胞增殖的質(zhì)量濃度范圍為50～200μg/mL，與對(duì)照相比有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)。金花茶種子95%乙醇提取物抑制U937和HCT116細(xì)胞增殖的IC50分別為37.48μg/mL和94.17μg/mL。

表2 金花茶種子95%乙醇提取物對(duì)U937細(xì)胞和HCT116細(xì)胞增殖的影響

2.3 金花茶葉子的抗腫瘤活性 對(duì)金花茶葉乙醇提取物和水提取抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)金花茶葉不同提取物都有很強(qiáng)的抑制U937細(xì)胞增殖的作用 (表3)。其中葉乙醇提取物抑制U937細(xì)胞增殖的質(zhì)量濃度范圍為20～200μg/mL，水提取的抑制質(zhì)量濃度范圍為50～200μg/mL，并且細(xì)胞存活率隨樣品質(zhì)量濃度的加大而降低 (與對(duì)照組相比，P＜0.05或P＜0.01)。金花茶葉乙醇提取物和水提取抑制U937細(xì)胞增殖的IC50分別為149.19 μg/mL和162.96μg/mL。而金花茶葉子的不同提取物對(duì)HCT116細(xì)胞增殖影響很小，結(jié)果表明沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 金花茶葉不同提取物對(duì)U937細(xì)胞和HCT116細(xì)胞增殖的影響

3 討論

本研究旨在探討金花茶不同植物部位對(duì)人白血病和結(jié)腸癌細(xì)胞株的抑制作用。在以前的研究中，金花茶葉是主要的藥用部位，富含氨基酸、茶皂苷、黃酮類(lèi)及多種微量元素［8-9］。具有降血脂、降壓和抗癌防癌等方面的功能［5，10-12］。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)金花茶不同植物部位抑制腫瘤細(xì)胞的活性進(jìn)行了考察。在研究中發(fā)現(xiàn)金花茶花抑制HCT116和U937細(xì)胞的IC50分別為48.48μg/m L和211.71 μg/mL，金花茶花抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用更為明顯。金花茶種子顯示了較強(qiáng)的抑制U937和HCT116細(xì)胞增殖的活性，其IC50分別為37.48μg/mL和94.17μg/mL，金花茶種子抑制U937細(xì)胞增殖作用更為明顯。而金花茶葉子不同提取物對(duì)U937細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，但是對(duì)HCT116細(xì)胞增殖抑制作用不明顯。本研究表明，金花茶花、種子和葉子均有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，在不同的腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)不同。而且與傳統(tǒng)的金花茶葉作為藥用部位相比，其花和種子有著更為顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的作用。這些發(fā)現(xiàn)為金花茶抗腫瘤研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為該植物資源開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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