抗乳增片對乳腺增生癥大鼠T細胞亞群及免疫分子的影響

周 會， 汪天明， 王 靚， 胡海霞， 白 玫

(安徽中醫藥大學中西醫結合臨床學院，安徽合肥230038)

現代研究表明，乳腺增生癥除了表現為內分泌激素失調外，還可表現為免疫分子及免疫細胞等含量及功能的異常。神經、免疫和內分泌系統在維護機體內環境的平衡中相互協調，組成信息分子相互調節的統一整體［1-2］。本實驗通過復制大鼠乳腺增生模型，考察抗乳增片對乳腺增生癥大鼠免疫系統的影響，進一步探討抗乳增片對大鼠乳腺增生的治療機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 普通級SD雌性未孕大鼠36只，體質量(250±16)g，由安徽醫科大學實驗動物研究中心提供。

1.2 實驗藥物 抗乳增片:安徽醫藥研究所提供;主要藥物:丹參、玄參、紅花、柴胡、香附、當歸、夏枯草、生牡蠣、山慈菇、海藻等。逍遙丸:湖南九芝堂股份有限公司，批號:090560;苯甲酸雌二醇注射液:上海通用藥業股份有限公司生產，批號:030402;紅細胞裂解液由美國kegene公司提供;流式細胞儀:EPICSELITE(美國B-C公司)。IL-2，TNF-α試劑盒購于解放軍總醫院東亞免疫所;T細胞亞群試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司 (抗體:PE標記的小鼠抗大鼠CD4+抗體，TC標記的小鼠抗大鼠CD8+抗體，FITC標記的小鼠抗大鼠CD3+抗體，以上抗體原產于美國CALTAG公司)。

2 實驗方法

2.1 大鼠乳腺增生模型的制備 SD雌性未孕大鼠36只，隨機分為6組:假手術組、模型對照組、陽性對照組和抗乳增片大、中、小劑量組。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，劑量為0.3 mL/100 g體質量。假手術組的大鼠不摘除卵巢，打開腹腔后重新縫合;其余各組的大鼠均摘除兩側卵巢。除了假手術組以外，其余各組大鼠于手術后第2天起隔天腹腔注射苯甲酸雌二醇 (劑量為0.3 mg/kg體質量)，連續15次，制造乳腺增生模型［3］。

2.2 給藥 造模后假手術組和模型組給予蒸餾水，灌胃。給藥組給藥容積均為10 mL/kg;抗乳增片大、中、小劑量組給予抗乳增片，劑量分別為2.34、0.78、0.26 g/kg體質量;陽性對照組給予逍遙丸，劑量為2.28 g/kg體質量。以上給藥連續4周，每日1次。

2.3 觀察指標 給藥4周后，腹主動脈放血處死大鼠。留取血液5 mL，2 mL立即離心 (3 000 r/min，5 min)制備血清，用放射免疫方法測定各組實驗性大鼠血清中IL-2和TNF-α的水平［3］。其余用于檢測T細胞亞群，取100μL血液置于EDTANa2抗凝管中，加入CD3+抗體、CD4+抗體和CD8+抗體。室溫下避光孵育30 min，加紅細胞裂解液3 mL，放置10 min后，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液。PBS洗滌，1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，上流式細胞儀檢測T細胞亞群［4］。

3 實驗結果

3.1 抗乳增片對大鼠血清中IL-2和TNF的影響 如表1，模型組大鼠血清中的TNF-α顯著高于假手術組，IL-2卻低于假手術組 (P＜0.05)。經抗乳增片治療組各鼠血清中IL-2顯著高于模型組而TNF-α顯著降低 (P＜0.05)。各劑量組之間的上述兩項指標無顯著差異 (P＞0.05)。

表1 抗乳增片對大鼠血清中IL-2和TNF-α的影響 (±s，n=6)

表1 抗乳增片對大鼠血清中IL-2和TNF-α的影響 (±s，n=6)

注:與模型組相比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分組 劑量/(g·kg－1)IL-2/(ng·mL－1)TNF-α/(ng·mL－1)假手術組 0.29±0.10＊＊ 1.58±0.26＊＊模型組 / 0.16±0.08 1.99±0.36抗乳增片大劑量組 2.34 0.32±0.09＊＊ 1.47±0.21*抗乳增片中劑量組 0.78 0.42±0.12＊＊ 1.48±0.03*抗乳增片小劑量組 0.26 0.31±0.07* 1.56±0.42逍遙丸組 2.28 0.27±0.07＊＊ 1.10±0.36＊＊

3.2 抗乳增片對大鼠外周血中T細胞亞群的影響 流式細胞儀檢測模型對照組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著低于假手術組(P＜0.05)，CD8+較假手術組稍高但無顯著性差異。抗乳增片治療組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+等指標有所提高，尤其是大劑量組上述指標與模型對照組有極顯著差異 (P＜0.01)，抗乳增片中劑量組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+等指標較模型組亦有所上調(P＜0.05)(見表2)。

表2 抗乳增片對大鼠血清中T細胞亞群的影響 (±s，n=6)

表2 抗乳增片對大鼠血清中T細胞亞群的影響 (±s，n=6)

注:與模型組相比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分 組 劑量/(g·kg－1) CD3+/% CD4+/% CD8+/% (CD4+/CD8+)假手術組 / 61.67±14．66* 32.70±4.77* 22.59±4.66 1.53±0.50*模型組 / 48.46±13．77 24.27±6.39 24.58±2.05 1.00±0.30抗乳增片大劑量組 2.34 63.94±10．30＊＊ 37.61±8.01＊＊ 32.27±4.41＊＊ 1.18±0.29抗乳增片中劑量組 0.78 63.79±6．48* 36.67±4.05＊＊ 26.12±4.85 1.44±0.03*抗乳增片小劑量組 0.26 59.71±5．53 30.25±3.30* 26.11±4.46 1.16±0.11逍遙丸組 2.28 59.48±10．62 33.26±6.79*27.78±8.63 1.31±0.54

4 討論

現代醫學認為乳腺增生的發病是內分泌的紊亂所引起，雌二醇分泌絕對或相對過高，孕酮水平低，以致月經周期中乳腺組織增生和復舊過程發生紊亂，使乳腺導管或腺泡上皮增生，乳管擴張成囊狀，形成腫塊［5-7］。研究表明T淋巴細胞是性激素的主要靶器官，雌二醇、孕酮分泌紊亂可導致機體自體免疫調節網絡系統呈現免疫抑制狀態及免疫調節功能的紊亂，出現免疫功能降低，免疫系統不能有效的識別、抑制和清除病變細胞而導致本病的發生。正常機體內體內CD3+(T輔助細胞)、CD4+(T抑制)細胞維持一定的比例，各淋巴細胞亞群相互作用，維持機體正常的免疫功能［8-9］。臨床研究發現，乳腺增生患者體內CD3+、CD4+水平稍低于正常值、CD4+/CD8+顯著低于正常值［10］。本實驗發現模型組大鼠CD4+/CD8+值降低顯著，CD3+、CD4+T細胞百分數亦有不同程度降低。CD4+/CD8+值發生改變說明乳腺增生模型大鼠淋巴細胞及其亞群在變化之中，機體免疫功能發生了紊亂，與報道一致。經抗乳增片治療的大鼠血清CD4+/CD8+值明顯上調，CD3+、CD4+T細胞百分數亦有所提高。

臨床研究也發現乳腺增生病患者免疫功能失調，與免疫相關的細胞因子如IL-2，TNF等參與機體的免疫調節。IL-2是由活化的TH1細胞或CD4+細胞產生，主要通過自分泌方式促進T細胞生長，可誘導殺傷異常增生細胞;TNF-α具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤的作用［11］。本研究中模型組大鼠血清中的 TNF-α顯著高于假手術組 (P＜0.05)，IL-2卻低于假手術組 (P＜0.05)。經抗乳增片治療組各鼠血清中IL-2顯著高于模型組而TNF-α顯著降低。表明抗乳增片能夠促進IL-2生成，抑制TNF-α的合成，對大鼠免疫系統具有一定的調節作用。

現代研究證實柴胡、香附、當歸等具有疏肝解郁、調節內分泌、增強機體免疫功能的作用，王桐生等報道香附可顯著提高小鼠吞噬指數，脾臟胸腺指數，增加脾臟淋巴細胞的增殖活化［12］。夏枯草、生牡蠣、山慈菇、海藻等則著重散結化痰通絡。紅花、丹參等中藥可活血祛瘀、調節免疫，抑制血小板聚集、改善微循環、抗腫瘤等作用。通過本實驗研究提示抗乳增片解郁散結，調節免疫之功，可能是通過調節T淋巴細胞亞群及IL-2、TNF-α等免疫分子的水平而實現的。對抗乳增片的前期的實驗研究中也發現模型組大鼠，脾臟指數、胸腺指數較假手術組均降低，抗乳增片治療組的脾臟、胸腺等免疫器官臟器指數顯著升高［13］。抗乳增片能有效提高乳腺增生大鼠的免疫功能，這可能是其抑制大鼠乳腺組織病變的另一機理。

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