鬼針草總黃酮超聲提取工藝優(yōu)選

杜利月，郭留城

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462002)

鬼針草為菊科(Composite)鬼針草屬 Bidens Pilosa L.植物，有230余種，分布于熱帶及溫帶地區(qū)，主產(chǎn)于美洲，具有廣泛的生物活性，有抗瘧、抑菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血壓、保肝、抗?jié)兊裙πВ叶拘詷O低[1－3]。為更有效地開發(fā)和利用藥材資源，充分提取鬼針草中所含的總黃酮成分，筆者采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲波提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)利用鬼針草提供參考。

1 儀器與試藥

KQ500DE型醫(yī)用超聲波(昆山市超聲儀器有限公司);Carry100型紫外可見分光光度計(jì)(美國瓦里安);RE3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。女貞子(藥用，漯河市廣惠和醫(yī)藥有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 生藥蘆丁含量測定

檢測波長選擇:精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品1.6 mg，以甲醇定容至 10 mL，即得 160μg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液3.5 mL，用甲醇稀釋至25 mL，即得22.4μg/mL蘆丁對照品溶液。以甲醇為空白，用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長。結(jié)果蘆丁在257 nm波長處有最大吸收。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別精密量取 0.5，2，3.5，5，6.5，8mL 的蘆丁對照品貯備液，并分別加甲醇至10mL，搖勻后在257 nm波長處進(jìn)行測定，以取樣量(X)為橫坐標(biāo)，樣品吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，得線性方程 Y=0.059 5X+0.004 1，r=0.999 3。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣量在8～128μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

總黃酮含量測定:以蘆丁對照品為標(biāo)樣測定鬼針草提取液中總黃酮含量。分別準(zhǔn)確量取提取樣品1.0mL置50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后于257 nm波長處進(jìn)行比色測定，以甲醇為空白對照。

回收率試驗(yàn):精密量取上述已知含量的鬼針草提取液，準(zhǔn)確加入蘆丁對照品 1.00mg，按2.1.3項(xiàng)下方法測定，得蘆丁的回收率為99.3%。

2.2 單因素試驗(yàn)

溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%)、溶劑用量(8倍)、提取時間(30min)和提取次數(shù)(3次)4個因素中選取任意一個因素的5個水平，固定另外3個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將提取液濃縮，用甲醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)，搖勻后，按照2.1項(xiàng)下含量測定方法測定含量，并計(jì)算鬼針草中總黃酮的含量。結(jié)果見表1。可見，溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)低時，總黃酮的含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)高時，總黃酮的含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。故選取50%乙醇作為溶劑。總黃酮的含量隨溶劑用量的增加而增加，但溶劑超過6倍用量時，總黃酮的含量增加的速度逐漸減慢。總黃酮的含量隨提取時間的增加而增加，提取時間超過40 min時，總黃酮的含量增加的速度逐漸減慢。總黃酮的含量隨提取次數(shù)的增加而增加，且提取次數(shù)超過3次時，總黃酮的含量增加的速度逐漸減慢。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取溶劑中提取時間(A)、提取次數(shù)(B)、溶劑用量(C)和溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)作為考察因素[4－5]，每個因素設(shè)計(jì)3個水平。結(jié)果見表2。按照 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，超聲提取，將提取液濃縮，用甲醇稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，搖勻后，按照2.1項(xiàng)下方法測定含量，計(jì)算鬼針草中總黃酮的含量，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表3和表4。結(jié)果表明，對試驗(yàn)結(jié)果影響因素由大到小的順序是提取時間＞提取次數(shù)＞溶劑用量＞溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)，其中提取時間對結(jié)果有顯著性影響。由方差分析結(jié)果可確定最佳超聲提取條件為A3B2C1D2，即以50%乙醇為溶劑，加6倍溶劑，超聲提取3次，每次提取50min。

2.4 提取工藝驗(yàn)證

為進(jìn)一步考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性，按該工藝條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次，測得鬼針草總黃酮的含量分別為9.81‰，9.87‰，9.84‰，平均 9.84‰，RSD 為 0.3% 。測定結(jié)果均等于或優(yōu)于正交試驗(yàn)表中的任何一組，重現(xiàn)性好，說明該工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析表

3 討論

鬼針草始載于《本草拾遺》，以干燥的全草入藥，味苦、性平、無毒，具有清熱解毒，活血、散瘀、消腫之功效，其活性成分以黃酮類為主[6]。鬼針草中蘆丁等黃酮類化合物因分子中有桂皮酰基及苯甲酰基組成的交叉共軛體系，具有相同的吸光度測試性質(zhì)，均在257 nm波長處有最大吸收峰，故選定在257 nm波長處進(jìn)行測定。在正交試驗(yàn)中，從總黃酮這一指標(biāo)來看，因素A的影響最大，差異性最顯著，所以選擇提取時間為50 min。本試驗(yàn)優(yōu)選出的工藝簡單，操作控制容易，穩(wěn)定性好，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]Chang SL，Chang CL，Chiang YM，etal.Polyacetylenic compounds and butanol fraction from Bidens pilosa canmodulate the differentiation of helper T cells and preventautoimmune diabetes in non－obese diabeticmice[J].Planta Med，2004，70(11):1 045 － 1 051.

[2]Atta AH，Mouneir SM.Evaluation of somemedicinal plant extracts for anti diarrhoealactivity[J].Phytother Res，2005，19(6):481 － 485.

[3]夏 勤.鬼針草腸溶膠囊急性毒性實(shí)驗(yàn)[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18(9):2 206.

[4]王小華，鄧 斌，張曉軍，等.紅薯葉黃酮類化合物提取及其抗氧化作用研究[J].糧食與油脂，2008(12):26－28.

[5]郭留城，杜利月.女貞子總黃酮超聲波提取工藝研究[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2009，21(3):262 －263.

[6]趙 燕，趙 瑩，王緒成.鬼針草的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥房，2007，18(15):1 189－1 190.