膽酸細菌內毒素檢查方法的建立

楊昀，胡宇馳，周建平，曹春然

(北京市藥品檢驗所，北京 100035)

膽酸在水中溶解度較低(15℃時僅為0.28 g/L)，無法采用一般的家兔法進行熱原項目檢查。鱟試劑與細菌內毒素的反應一般都是在水溶液中進行，也無法直接用細菌內毒素檢查用水溶解本品進行細菌內毒素凝膠法檢查。膽酸可溶于乙醇(15℃時在乙醇中的溶解度為30.56 g/L)，也溶于堿溶液，因此考慮以乙醇或堿性溶液為溶劑，將膽酸溶解后進行細菌內毒素檢查。有研究將膽酸分別與1.0mol/L的NaOH溶液和細菌內毒素檢查用水混合溶解，稀釋后制成質量濃度為0.375 g/L的供試品溶液后再進行細菌內毒素檢查。但堿性溶液對于膽酸中可能含有的細菌內毒素是否有干擾作用，尚無進一步研究的資料。因此，本試驗分別使用無水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液分別溶解膽酸，進行細菌內毒素方法學研究;并采用外加細菌內毒素的方法，研究無水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液溶解膽酸是否對細菌內毒素產生干擾。

1 試驗材料

膽酸原料，類白色粉末，3批樣品(New Zealand Pharmaceuticals Ltd.，批號分別為 0310107，0310108，0310109);鱟試劑(福州新北生化工業有限公司，批號為11110812，靈敏度為0.125EU/mL;批號為 12040612，靈敏度為 0.03 EU/mL，規格均為 0.1mL);鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號為1109071，靈敏度為0.25 EU/mL;批號為 1104211，靈敏度為 0.125 EU/mL，規格均為0.1mL);細菌內毒素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號為150601－201072，規格為每支120 EU);細菌內毒素檢查用水(中國藥品生物制品檢定所，批號為201001，規格為每支10mL);無水乙醇(北京現代東方精細化學品有限公司，批號為20111118)為分析純。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核

按照2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE細菌內毒素檢查法規定[1]，進行鱟試劑靈敏度復核，結果4批鱟試劑用細菌內毒素標準品檢查，λc均為 λ的0.5～2.0倍，表明鱟試劑的靈敏度均符合規定。

2.2 內毒素限值(L)確定

膽酸為藥用輔料，內控標準內毒素的限值為360 EU/g。

2.3 膽酸有效稀釋濃度(MVC)

按公式 MVC=λ/L計算，其中L為膽酸的細菌內毒素限值360 EU/g，λ為鱟試劑標示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常是 0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL。則對應的膽酸有效稀釋質量濃度分別為 1.39，0.69，0.35，0.17，0.087 g/L。

2.4 膽酸溶液制備

由于膽酸微溶于水，無法直接制備水溶液進行細菌內毒素試驗。但膽酸可溶于乙醇(15℃時在乙醇中的溶解度為30.56 g/L)，也溶于堿溶液，因此分別以無水乙醇和1.0mol/L的NaOH溶液為溶劑，將膽酸溶解后再進行細菌內毒素方法學試驗。

2.5 干擾試驗預試驗

2.5.1 無水乙醇處理

精密稱取膽酸140mg，加入無水乙醇5mL，超聲振蕩1min溶解制成膽酸貯備液。再將貯備液中加入細菌內毒素檢查用水，分別稀釋為 1.4，0.7，0.35，0.175，0.087 5 g/L，將此系列稀釋溶液記為NPC(此系列稀釋溶液中的乙醇濃度分別為5%，2.5%，1.25%，0.625% ，0.312 5%，以下均同)。

為驗證經無水乙醇處理和短時間超聲振蕩對細菌內毒素的影響，另精密稱取膽酸140mg，加入無水乙醇5mL，細菌內毒素標準品適量，超聲振蕩1min溶解，制成含有細菌內毒素的膽酸貯備液。將上述貯備液稀釋成上述系列濃度，并使每一濃度的稀釋液中分別含有2λ及0.25λ濃度的細菌內毒素，此系列溶液分別記為PPC1和PPC2。

取靈敏度分別為0.25，0.125 EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC1，PPC2和NPC系列溶液進行反應;并以細菌內毒素檢查用水設立陽性和陰性對照，記為NC，依法進行干擾試驗預試驗。結果見表 1。可見，膽酸在 0.35 g/L(乙醇濃度1.25%)及其以下稀釋濃度時對試驗無干擾，且說明無水乙醇的處理和短時間內的超聲振蕩在一定程度內未對細菌內毒素干擾預試驗結果產生影響。

表1 膽酸干擾預試驗結果(無水乙醇處理/0.1mol/LNaOH溶液處理)

2.5.2 1.0mol/LNaOH 溶液處理

精密稱取膽酸 350mg，加入 1.0mol/LNaOH 溶液 0.8mL，細菌內毒素檢查用水9.2mL充分振蕩溶解，制成膽酸貯備液，據需要，調節膽酸貯備液pH在6～8之間。再將貯備液中加入細菌內毒素檢查用水分別稀釋為 1.4，0.7，0.35，0.175，0.087 5 g/L，將此系列稀釋溶液記為NPC。

為驗證經1.0mol/LNaOH溶液處理對細菌內毒素的影響，另精密稱取膽酸 350mg，加入 1.0mol/LNaOH 溶液 0.8mL，細菌內毒素檢查用水9.2mL及細菌內毒素標準品適量，充分振蕩，制成含細菌內毒素的膽酸貯備液。將上述貯備液稀釋成上述系列濃度，并使每一濃度的稀釋液中分別含有2λ及0.25λ濃度的細菌內毒素，此系列溶液分別記為PPC1和PPC2。

取靈敏度分別為0.25，0.125 EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC1，PPC2和NPC系列溶液進行反應;并以內毒素檢查用水設立陽性和陰性對照，記為NC，依法進行干擾試驗預試驗。結果見表1。可見，經1.0mol/LNaOH溶液處理膽酸后，細菌內毒素干擾試驗不成立。

2.6 正式干擾試驗(無水乙醇處理)

根據表1兩種處理方法的預試驗結果，將3個批號的膽酸按2.5.1項下步驟處理后，取膽酸貯備液用細菌內毒素檢查用水分別進行稀釋，使其最終干擾試驗稀釋質量濃度為0.35 g/L(乙醇濃度1.25%)，按2010年版《中國藥典(二部)》附錄中的細菌內毒素檢查供試品干擾試驗項進行試驗，結果見表2。結果表明，E s/E t均在0.5～2.0范圍內，確認膽酸經無水乙醇處理后在0.35 g/L(乙醇濃度1.25%)的稀釋質量濃度下無干擾。

2.7 樣品細菌內毒素檢查

分別選擇靈敏度分別為0.03，0.125 EU/mL的兩個廠家的鱟試劑，按2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE細菌內毒素檢查法，對上述3批樣品進行細菌內毒素檢查，均符合規定。結果見表3。

3 討論

膽酸微溶于水，因此無法采用一般的家兔法進行熱原項目檢查;凝膠法為細菌內毒素6種檢查方法中最簡單和常用的方法，且為細菌內毒素第一類檢查的評估標準方法[2]，因此建立膽酸的細菌內毒素檢查凝膠法非常必要。但鱟試劑凝膠反應一般是在水溶液中進行，因此需要解決膽酸在水中溶解度較低的問題。

膽酸可溶于乙醇，也溶于堿性溶液，本試驗分別采用這兩種溶劑進行試驗研究。一般情況下乙醇對細菌內毒素有去除作用[3]。但另有文獻報道，60%的乙醇溶液及超聲對細菌內毒素的活性無明顯影響，乙醇濃度稀釋至4%～5%以下對內毒素和鱟試劑的凝集反應也無明顯干擾作用[4－5]。參照本試驗結果，本研究將細菌內毒素標準品外加入膽酸原料中，并用無水乙醇和超聲振蕩進行短暫處理，制成貯備液，并將貯備液進一步稀釋制成供試品溶液進行細菌內毒素方法學驗證。結果表明，無水乙醇短暫處理及短時間的超聲振蕩對細菌內毒素的活性無明顯影響。而且經一系列稀釋后，最終進行鱟試劑凝膠反應的供試品溶液中所含的乙醇濃度為5%及其以下濃度，對鱟試劑的凝集反應也未產生明顯干擾作用。

在膽酸中預先外加細菌內毒素標準品后再使用1.0mol/L NaOH溶液和細菌內毒素檢查用水溶解，干擾預試驗不成立。此時溶液的pH在8～9之間，推測并非是pH對鱟試劑的凝集產生干擾。另取膽酸按擬訂方法溶解后再外加細菌內毒素溶液，干擾消失，干擾預試驗成立。由此推測1.0mol/LNaOH溶液溶解膽酸，發生酸堿中和反應，其反應過程對細菌內毒素產生影響，造成干擾試驗不成立。根據2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE[1]要求，應使用預先添加標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。因此，使用1.0mol/LNaOH溶液溶解膽酸的方法不適用于膽酸的細菌內毒素凝膠法檢查。

由于鱟試劑生產廠家不同，工藝不同，對供試品的抗干擾能力不同，故應根據實際情況選擇適合的試驗材料。

表2 膽酸(無水乙醇處理)正式干擾試驗結果

表3 膽酸(無水乙醇處理)細菌內毒素檢查結果

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅪE.

[2]張新妹，胡昌勤，王淑蘭.歐洲藥典(附錄2.6.14)[J].中國藥品標準，2004，5(5):60 － 62.

[3]聞 平.乙醇除細菌內毒素污染的效果觀察[J].中國醫學檢驗雜志，2001，2(6):421 －422.

[4]楊先啟.紫杉醇細菌內毒素檢測方法的探討[J].安徽醫藥，2005，9(5):356－357.

[5]張震宇，章小萍，馬玉萍，等.紫杉醇脂質體細菌內毒素的檢測[J].中國醫藥工業雜志，2001，2(6):266 －267.