反相高效液相色譜法測(cè)定燈盞細(xì)辛中燈盞乙素含量

聶朝霞

(湖南省衡陽(yáng)市婦幼保健院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

燈盞花素(Breviscapine)是從菊科短莛屬燈盞細(xì)辛中提取分離的黃酮類(lèi)有效成分，主要成分為燈盞乙素(Scutellarin)，化學(xué)名為4’，5，6－三羥基－甲酮－7－葡萄糖醛酸苷，具有擴(kuò)張微血管、增加動(dòng)脈流量、降低血液黏度、減少外周阻力、抑制血小板聚集等作用[1]，臨床用于治療冠心病、心絞痛、心肌缺血損傷、血栓形成等[2]。本研究建立了燈盞細(xì)辛中燈盞乙素的分析方法，可作為燈盞細(xì)辛質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，包括Waters2996二極管陣列檢測(cè)器，515型高壓泵，Waters717自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower Pro色譜工作站);AllegraTM X－ZZR Centrifuge冷凍離心機(jī)(貝克曼公司);UV－260型紫外分光光度儀(日本島津公司);BA110S型電子分析天平(德國(guó));KQ－300DE型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。燈盞乙素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為842－200102);燈盞細(xì)辛藥材(湖南衡陽(yáng)瑞源醫(yī)藥公司);甲醇為色譜純(美國(guó)Fishers公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:甲醇 －水(1∶1，1mol/L磷酸調(diào)節(jié) pH至2.5);流速:1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):335 nm;柱溫:35℃。進(jìn)樣量:10μL。理論板數(shù)按燈盞乙素計(jì)算應(yīng)不低于3 000，此條件下，燈盞乙素(tR=8.3min)與相臨色譜峰分離度大于1.5，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱(chēng)取燈盞乙素對(duì)照品8mg，置100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，得燈盞乙素標(biāo)準(zhǔn)貯備液(80μg/mL)，避光4℃冰箱保存，臨用時(shí)將貯備液用流動(dòng)相稀釋至所需濃度，即得對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取藥材粉末(過(guò)50目篩)0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入蒸餾水25mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(300W，40 kHz)45min，放冷，密塞，再稱(chēng)定質(zhì)量，用蒸餾水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，以15 000 r/min的速度離心15min，精密量取續(xù)濾液1mL置10mL棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密吸取燈盞乙素對(duì)照品溶液(20μg/mL)0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mL 置 10mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件依次進(jìn)樣10μL，測(cè)定。記錄峰面積，以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=2.54 ×104X+612.86，r=0.999 9。結(jié)果表明，燈盞乙素質(zhì)量濃度在0.25～8.00μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液的稀釋液(2.0μg/mL)，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果燈盞乙素峰面積的 RSD為0.59%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱(chēng)取同一批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣6次，依法測(cè)定。結(jié)果燈盞乙素平均含量為 1.79 mg/g，RSD 為 0.99%(n=6)，表明該試驗(yàn)重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，在擬訂色譜條件下，分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果燈盞乙素峰面積的 RSD 為0.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱(chēng)取已知燈盞乙素含量的藥材粉末9份，每份0.5 g，分別精密加入燈盞乙素對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.8%，RSD為1.1%(n=9)。

2.4 樣品含量測(cè)定

按2.2項(xiàng)下方法制備各不同來(lái)源的燈盞乙素的供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)行反相高效液相色譜分析，按外標(biāo)法計(jì)算各收集的燈盞細(xì)辛中燈盞乙素的百分含量，見(jiàn)表1。

表1 燈盞細(xì)辛中燈盞乙素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

根據(jù)測(cè)定目標(biāo)表化合物燈盞乙素的理化性質(zhì)和文獻(xiàn)，分別考察提取溶劑(95%乙醇、甲醇、水)、提取方式(回流、超聲提取)、溶劑量、提取時(shí)間，確定最佳提取條件為:以50倍量乙醇超聲提取45min。此方法簡(jiǎn)便易行，燈盞乙素提取率最高，測(cè)定時(shí)干擾物質(zhì)少。

根據(jù)文獻(xiàn)資料，參考燈盞乙素含量測(cè)定方法。選擇了3種色譜柱:Kromasil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5μm);Hypersil ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5 μm)色譜柱。分別選用 0.01% ，0.035% ，0.05% 的磷酸溶液與甲醇組成(甲醇－磷酸溶液=50∶50)3種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)比較，結(jié)果以甲醇－0.035%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相時(shí)分離度、燈盞乙素的峰形好，故選用甲醇－0.035%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相。流速為1.0mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm時(shí)，供試品中燈盞乙素得到了較好的分離，理論板數(shù)不低于3 000，分離度大于 1.5。

取一定量已知質(zhì)量濃度的燈盞乙素對(duì)照品溶液，于190～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在335 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，確定335nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

對(duì)不同產(chǎn)地的燈盞細(xì)辛樣品中燈盞乙素含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同的產(chǎn)地之間差異較大。這與楊生超等[3]的研究結(jié)果基本一致，可能在燈盞細(xì)辛的自然選擇過(guò)程中發(fā)生了遺傳分化有關(guān)。鑒于文獻(xiàn)報(bào)道燈盞細(xì)辛中燈盞乙素有較好改善心腦血管疾病的作用，故將燈盞乙素的含量作為藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本研究為燈盞細(xì)辛藥材及制劑質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

[1]程 英，陳 鑫，朱志安，等.燈盞花素對(duì)大鼠腦挫裂傷腦組織線粒體ATP酶活性及SOD和MDA水平的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，18(2):58 －60.

[2]陳新謙，金有豫.新編藥物學(xué)[M].第14版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1997:277.

[3]楊生超，張雪峰，李 黎，等.燈盞花種質(zhì)資源燈盞乙素和咖啡酸醋含量[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34(2):239 －240.