超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定云南雪膽和云南地不容的研究

楊 艷 陳旭冰 陳光勇 劉光明

1.云南省大理州人民醫(yī)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院藥學(xué)院，云南大理 671000

云南雪膽（Hemsleya sinesis Cogn of Yunnan）為葫蘆科（Cucurbitane）雪膽屬（Hermleya）植物的干燥塊根，具有清熱、解毒、消腫止痛的功效，民間用來(lái)治療肝炎、氣管炎、胰腺炎、慢性子宮頸炎、帶狀皰疹、腫瘤等[1-5]。云南地不容（Stephania yunnanensis H.S.Lo）為防己科（Menisermaceae）千金藤屬（Stephania）植物的干燥塊根，具有清熱、解毒、鎮(zhèn)靜、止痛、理氣等功能，民間用于治療風(fēng)濕骨痛、胃痛、毒蛇咬傷等[6-7]。云南雪膽和云南地不容均為云南著名的傳統(tǒng)中草藥，民間使用較為廣泛，二者均為干燥塊根，從外形上看極其類似，很容易混淆，給人們的使用帶來(lái)諸多不變。因此，建立一種快速檢測(cè)方法，以區(qū)分兩種藥材是非常必要的。

超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）作為一種新的檢測(cè)技術(shù)，廣泛用于各種分析檢測(cè)領(lǐng)域，它可以同時(shí)獲得液相色譜和質(zhì)譜圖，根據(jù)離子流信息計(jì)算出化合物的分子量，分析各種離子碎片可以確定化合物的結(jié)構(gòu)式，從而在樣品不純時(shí)便能知道其主要成分，這對(duì)于天然產(chǎn)物的研究極為重要。本研究采用UPLC-MS對(duì)云南雪膽和云南地不容進(jìn)行檢測(cè)，從而建立一種鑒別兩種藥材的快速檢測(cè)方法，為研究和使用兩種藥材提供一定依據(jù)。

1 材料與儀器

云南雪膽和云南地不容藥材購(gòu)自云南省藥材公司（分別產(chǎn)自云南西雙版納和云南文山），經(jīng)大理學(xué)院藥學(xué)院周濃副教授鑒定為葫蘆科雪膽屬植物雪膽Hemsleya sinesis Cogn of Yunnan 和防己科千金藤屬植物云南地不容Stephania yunnan ensis H.S.Lo的干燥塊根；標(biāo)準(zhǔn)品左旋四氫巴馬汀Tetrahydropalmatine 和雪膽甲素CucurbitacinⅡa購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；實(shí)驗(yàn)試劑均為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。電子分析天平（Startorius CPA225D）；液相色譜/單極四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Waters，ACQUITY SQD LC/MS System）；C18反 相 柱（Waters，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備

分別將云南雪膽和云南地不容塊狀根粉碎，各取5 g 置于250 mL 茄形瓶中，加入95%乙醇各125 mL，于80℃下水浴加熱2 h，濾去殘?jiān)?，分別將提取液減壓蒸干至無(wú)醇味。分別將提取物用甲醇溶解置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品。

2.2 UPLC 條件

檢測(cè)樣品采用超高效液相色譜儀（Waters，ACQUITY UPLC H-class core system），配有超高效液相紫外檢測(cè)器（Waters，ACQUITY UPLC TUV Detector）， 色譜柱采用 C18反相柱（Waters，ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫 45℃。乙腈為色譜純（Merck，gradient grade for liquid chromatography），水為純凈水。展開劑采用乙腈-水，從10%（V/V）到100%乙腈梯度洗脫，時(shí)間為6 min[8]。

2.3 UPLC-MS 檢測(cè)

采用液質(zhì)聯(lián)用儀（ACQUITY SQD LC/MS System）進(jìn)行檢測(cè)，單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器，ESCI 離子源，電噴霧所用氣體為氮?dú)狻?/p>

2.4 檢測(cè)結(jié)果

云南雪膽和云南地不容經(jīng)UPLC-MS 檢測(cè)，結(jié)果見圖1、2。圖1A 中，所含主要成分保留時(shí)間為2.56 min，在負(fù)離子譜（圖 2A）中觀察到負(fù)離子峰如下：561.5（[M-H]-），607.5（[M+COOH]-），1169.8（[2M+COOH]-）。在正離子譜（圖 2B）中觀察到正離子峰如下：503.4（[M-AcO]+），1147.6（[2M+Na]+）。很容易確定其分子量為562.5，與文獻(xiàn)報(bào)道雪膽中所含主要成分雪膽甲素的分子量一致，所以確定該藥材為雪膽。圖1B 中，所含主要成分保留時(shí)間為1.83 min，在正離子譜（圖 2C）中觀察到離子峰如下：356.3（[M+H]+），357.3（[M+2H]2+），確定其分子量為355.3，與文獻(xiàn)報(bào)道云南地不容所含主要成分左旋四氫巴馬汀的分子量一致，確定該藥材為云南地不容（云南地不容沒有負(fù)離子譜）。將供試品的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)照，保留時(shí)間一致，質(zhì)譜圖一致，證明該方法準(zhǔn)確無(wú)誤。

圖1 云南雪膽和云南地不容UPLC

3 討論

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2 μm）和超高壓系統(tǒng)（壓力大于105 kPa）的新型液相色譜技術(shù)，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究。2004年3月，Waters公司率先推出了第一臺(tái)商品化的超高效液相色譜系統(tǒng)（acquity，UPLC TM）。自問世以來(lái)，超高效液相色譜發(fā)展很快，現(xiàn)已成功應(yīng)用于農(nóng)藥殘留物檢測(cè)、水質(zhì)和環(huán)境監(jiān)測(cè)、化妝品質(zhì)量控制、藥物及制劑的分析檢測(cè)和質(zhì)量控制、中藥復(fù)雜組分分析及代謝組學(xué)等領(lǐng)域[9-10]。云南雪膽所含主要成分雪膽甲素的保留時(shí)間為2.56 min，通過負(fù)離子和正離子譜，可確認(rèn)云南雪膽的分子量為562.5。云南地不容主要成分左旋四氫巴馬汀的保留時(shí)間為1.83 min，通過正離子譜，可確認(rèn)其分子量為355.3，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，從而可快速對(duì)上述兩種外形較為相似的中藥材進(jìn)行快速鑒別。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS 檢測(cè)云南雪膽和云南地不容，對(duì)其主要成分的質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，并對(duì)主要離子峰進(jìn)行歸屬，確定分子量，從而鑒別兩種藥材。天然產(chǎn)物的品種繁多，許多藥材外形極其類似，容易混淆，采用UPLC-MS 檢測(cè)，可以在不分離純化的前提下，快速確定其主要成分，從而鑒定藥材，方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

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