巴戟天醇提物對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

張向前 王雪俠

1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450052；2.河南電力醫(yī)院檢驗科，河南鄭州 450005；3.鄭州市婦幼保健院檢驗科，河南鄭州 450012

嚴(yán)重腎挫傷、復(fù)雜腎手術(shù)等處理過程中容易引發(fā)腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI），嚴(yán)重者可能會導(dǎo)致腎衰竭，因此，在進(jìn)行腎手術(shù)治療的同時，保護(hù)腎組織免受損傷成為了目前臨床中的研究熱點[1]。以往多采用缺血預(yù)適應(yīng)的方法防治手術(shù)引發(fā)的腎IRI。近年來，隨著減輕缺血再灌注損傷藥物的研究進(jìn)展，人們逐漸傾向于應(yīng)用更為簡單的藥物預(yù)適應(yīng)的方法防治IRI。雙子葉植物茜草科植物巴戟天最早應(yīng)用于陽痿早泄、月經(jīng)不調(diào)等疾病的治療。研究表明，巴戟天醇提物能夠保護(hù)IRI 心肌組織，且能夠延緩大鼠的衰老[2-3]。本研究旨在通過觀察巴戟天醇提物對大鼠腎IRI后血清尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）水平、腎組織超氧化物歧化酶（superoxidase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，腎細(xì)胞凋亡情況的變化，進(jìn)而探討巴戟天醇提物對腎IRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

巴戟天醇提物提取自巴戟天（一等品，廣東省德慶縣藥材公司，河南省食品藥品檢驗所鑒定）；SOD、GSH-Px、MDA、考馬斯亮蘭蛋白測試盒（批號：20120312、20120317、20120314、20120319）均購自南京建成生物工程研究所；TUNEL 法檢測試劑盒（批號：14751125471）購自美國Roche公司；c8000 全自動生化分析儀購自美國Abbott Laboratories公司；722型分光光度計購自上海第三分析儀器廠；Biofuge Stratos 臺式高速低溫離心機(jī)（德國Heraeus公司）。

1.2 實驗動物及分組

80只健康 Wistar大鼠，雄性，6月齡，體重 220～289 g，平均（245 ±25）g，購自河南省實驗動物中心。將其隨機(jī)均分為假手術(shù)組、IRI模型組、巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組4組，每組各20只。

1.3 給藥方法

各組大鼠均正常飼養(yǎng)，巴戟天高、低劑量組大鼠均連續(xù)灌胃給予一定濃度的巴戟天醇提物 3.0 g/（kg·d）、1.5 g/（kg·d），而假手術(shù)組和IRI模型組大鼠僅給予生理鹽水灌胃，用藥7d后，建立腎IRI模型。腎IRI模型建立方法：大鼠禁食12 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 μL/g）麻醉；常規(guī)消毒和術(shù)前準(zhǔn)備；于下腹部正中做一長約2.5cm的切口，進(jìn)入腹腔，向上提起腎臟，并切除右側(cè)腎臟；用無創(chuàng)小血管夾夾閉左側(cè)腎動脈，使之缺血1 h，然后再復(fù)灌4 h，此時模型制作完畢。其中假手術(shù)組僅做腹部切口，游離雙側(cè)腎臟，分離雙側(cè)腎臟動脈。其余3組均按上述步驟制作腎IRI模型。

1.4 BUN、Cr、SOD、GSH-Px 和 MDA 水平及腎臟組織病理變化的觀察

灌流結(jié)束后，每組取10只大鼠，采集靜脈血3 mL，4℃下以3 000 r/min 離心15 min，檢測BUN 及Cr水平；然后將這10只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，取出左側(cè)腎臟，稱取100 mg 用生理鹽水制成勻漿，4℃下以3 000 r/min離心15 min，取適量上清液，檢測SOD、GSH-Px 和MDA水平，其中總蛋白檢測采用考馬斯亮蘭法。上述操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 腎細(xì)胞凋亡的檢測方法

灌流結(jié)束后，每組剩余10只大鼠取左側(cè)腎臟，用40 g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，最后制成4 μm 切片。首先進(jìn)行HE 染色，觀察腎臟組織的病理變化；然后進(jìn)行TUNEL 染色。TUNEL 染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)色者為正常腎細(xì)胞；單個細(xì)胞，細(xì)胞周圍未見炎癥反應(yīng)，包膜明顯皺縮，細(xì)胞核致密深染呈棕黃色。低倍鏡下選擇陽性表達(dá)明顯的區(qū)域，然后在400倍鏡下選擇5個視野計數(shù)凋亡細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)量，并按照公式[凋亡指數(shù)=總凋亡細(xì)胞數(shù)/總觀察細(xì)胞數(shù)×100%]計算腎臟的凋亡指數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，符合兩個條件者，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進(jìn)行比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎缺血再灌注損傷后HE 染色結(jié)果及血尿素氮、肌酐水平

HE 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎臟組織未見明顯的異常；IRI模型組大鼠腎臟組織腎間質(zhì)輕度水腫，血管明顯擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死，少數(shù)管腔內(nèi)可見蛋白管型和（或）少量紅細(xì)胞；2個巴戟天組大鼠腎臟組織損傷均較IRI模型組明顯減輕，其中巴戟天高劑量組減輕更明顯。與IRI模型組相比，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組血清 BUN、Cr水平降低（P＜0.05）；巴戟天低劑量組血清BUN、Cr水平高于巴戟天高劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠腎缺血再灌注損傷后血清血尿素氮、肌酐水平比較（±s）

表1 大鼠腎缺血再灌注損傷后血清血尿素氮、肌酐水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與IRI模型組比較，*P＜0.05；與巴戟天高劑量組比較，※P ＜0.05；BUN：尿素氮，Cr：肌酐

組別 只數(shù)BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）假手術(shù)組IRI模型組巴戟天高劑量組巴戟天低劑量組F值P值10 10 10 10 10.59 ±1.23 63.12±7.35△22.17±3.92*30.68±5.11*※26.987＜0.001 35.67 ±8.16 219.44 ±32.0△100.33 ±24.97*156.51.1 ±27.29*※682.782＜0.001

2.2 腎缺血再灌注損傷后腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛水平

與IRI模型組比較，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組腎組織中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低（P＜0.05）；巴戟天低劑量組SOD、GSH-Px水平低于巴戟天高劑量組，而MDA水平高于巴戟天高劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠腎缺血再灌注損傷后腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛比較（±s）

表2 大鼠腎缺血再灌注損傷后腎組織中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和丙二醛比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與IRI模型組比較，*P＜0.05；與巴戟天高劑量組比較，※P ＜0.05；SOD：超氧化物歧化酶，GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶，MDA：丙二醛

組別 只數(shù)SOD（U/mgport）GSH-Px（U/mgport）MDA（nmol/mgport）假手術(shù)組IRI模型組巴戟天高劑量組巴戟天低劑量組F值P值10 10 10 10 150.67 ±19.25 67.56 ±11.32△110.68 ±15.24*95.27 ±14.78*※96.998＜0.001 110.69±14.63 41.81 ±8.46△70.53±10.73*60.34±11.22*※233.767＜0.001 3.27 ±0.78 7.54 ±1.02△3.94 ±1.07*5.45 ±0.87*※103.125＜0.001

2.3 腎缺血再灌注損傷后凋亡指數(shù)

與IRI模型組比較，巴戟天高劑量組和巴戟天低劑量組腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)降低（P＜0.05）；巴戟天低劑量組腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)高于巴戟天高劑量組（P＜0.05）。見表3。

3 討論

腎IRI是一種過程復(fù)雜、影響因素眾多的病理生理學(xué)過程，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎缺血性功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，另外IRI的發(fā)生也是腎移植手術(shù)失敗的主要原因之一。大量研究表明，腎IRI的形成可能與自由基過剩、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[4-5]。當(dāng)體內(nèi)自由基過剩時，就會對機(jī)體產(chǎn)生負(fù)性影響，造成機(jī)體生物膜的損傷，生成大量的MDA等過氧化脂質(zhì)體，而MDA 不僅是過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其本身也會進(jìn)一步加重機(jī)體的損傷，MDA的體內(nèi)水平在一定程度上反映了機(jī)體過氧化的程度以及腎組織受損程度[6]。SOD 及GSH-Px均是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)過剩的自由基，兩者的體內(nèi)水平一定程度上反映了機(jī)體的清除自由基的能力[2，7-8]。腎IRI 情況較重時腎組織會出現(xiàn)器質(zhì)性病變，例如線粒體膜損傷、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，腎IRI 主要以腎小管細(xì)胞的凋亡和壞死為特征，且細(xì)胞的凋亡、壞死與早期腎組織內(nèi)的自由基過剩以及機(jī)體清除自由基能力下降關(guān)系密切[11-12]。

表3 大鼠腎缺血再灌注后凋亡指數(shù)比較

本研究結(jié)果顯示：腎IRI大鼠血清BUN、Cr水平均較假手術(shù)大鼠升高，且HE 染色示大鼠腎組織有壞死變性情況的發(fā)生，而BUN水平升高提示腎小球過濾功能降低、Cr水平升高，HE 染色示的變性壞死則提示腎實性組織發(fā)生損傷，因此這提示腎IRI大鼠腎組織損傷嚴(yán)重，提示造模型成功；而應(yīng)用巴戟天醇提物的大鼠BUN 及Cr水平低于腎IRI大鼠，且HE 染色結(jié)果示腎組織變性壞死程度減輕，說明巴戟天醇提物能夠保護(hù)IRI 腎組織，另外巴戟天醇提物兩個劑量組的BUN、Cr水平差異還提示其抗腎IRI 作用具有一定的劑量依賴性。本研究結(jié)果還顯示：IRI大鼠的腎組織SOD、GSH-Px水平低于假手術(shù)大鼠，而MDA水平高于假手術(shù)大鼠，進(jìn)一步驗證了腎IRI 發(fā)生的自由基學(xué)說；與IRI大鼠相比，巴戟天醇提物兩個劑量組大鼠腎組織中SOD、GSH-Px水平升高，而MDA水平降低，且兩個劑量組的3 種因子水平有差異，提示巴戟天醇提物的抗腎IRI 作用可能與其具有劑量依賴性的抗氧化作用有關(guān)。本研究關(guān)于腎IRI 發(fā)生后細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn)，IRI大鼠的腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于假手術(shù)大鼠，提示細(xì)胞凋亡的發(fā)生是IRI 形成的病理基礎(chǔ)；與IRI大鼠相比，巴戟天醇提物兩個劑量組大鼠腎組織凋亡指數(shù)降低，且兩個劑量組凋亡指數(shù)有差異，提示巴戟天醇提物能夠通過其具有劑量依賴性的抗細(xì)胞凋亡作用減輕腎IRI。

綜上所述，巴戟天醇提物能夠保護(hù)腎IRI后的腎組織，這可能與其具有抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。

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