孔圣枕中丹對自發性高血壓大鼠前額葉皮質及紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2蛋白和基因表達的影響

陳曉剛 譚麗麗 賴東蘭 許雙虹 李宜瑞

1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院兒科，廣東廣州 510405；2.廣州市第八人民醫院兒科，廣東廣州 510060

注意缺陷多動障礙（attentiondeficithyperactivitydisorder，ADHD），是以注意力不集中、多動、沖動等為主要表現的常見兒童行為障礙，嚴重危害兒童的身心健康。以哌甲酯為代表的中樞興奮劑雖是目前治療ADHD的首選，但也存在不良反應較多、管理困難等諸多問題[1]。大量臨床實踐發現，中醫藥治療ADHD具備獨特優勢[2-3]。本研究檢測了孔圣枕中丹煎劑對ADHD動物模型——自發性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR）前額葉皮質及紋狀體（含伏核）中的酪氨酸羥化酶（TH）、多巴胺轉運體（DAT）、多巴胺D1受體（DRD1）、多巴胺D2受體（DRD2）的基因和蛋白表達的影響，并與鹽酸哌甲酯對照，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性8周齡的SHR大鼠36只，體重240～300 g，由四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所生產供應部提供[許可證號：SCXK（111）2008-16]。

1.2 主要儀器與試劑

DAB顯色試劑盒，SA1022兔IgG試劑盒，鼠IgG試劑盒，大鼠IgG試劑盒，原位雜交試劑盒（博士德生物技術有限公司）；TH 抗體：兔抗（Miliproe抗體公司）；DAT 抗體：大鼠抗體（abcam抗體公司）；DRD1抗體：兔抗（abcam抗體公司）；DRD2抗體：小鼠抗體（Santa抗體公司）。顯微鏡（日本OLYMPUS公司CHK2-F-GS型），離心機（上海安亭TGL-16G型），電熱恒溫水箱（廣州東方YH140-1型）。

1.3 孔圣枕中丹煎劑的制備

孔圣枕中丹方由龍骨、龜板、遠志、石菖蒲4味中藥組成（比例 4∶2∶1∶2），廣州中醫藥大學第一附屬醫院門診部藥房提供生藥，制成水煎劑，并配成含生藥約1.154 g/mL的溶液，充分攪勻，貯于4℃冰箱備用。鹽酸哌甲酯（蘇州醫藥集團有限公司）終濃度為0.24 g/L。

1.4 實驗動物分組及處理

圖1 免疫組化法檢測三組自發性高血壓大鼠前額葉皮質TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（ABC 法，200×）

所有大鼠隨機分為三組（孔圣枕中丹組、鹽酸哌甲酯組及生理鹽水對照組），每組12只（其中6只用于免疫組化實驗，6只用于原位雜交實驗）。稱重，編號，用灌胃針分別對三組大鼠進行灌胃，其中，孔圣枕中丹灌藥量：7.2 g/kg；鹽酸哌甲酯灌藥量：1.5 mg/kg（均稀釋為25 mL/kg后灌服），生理鹽水對照組灌服生理鹽水25 mL/kg。灌藥28 d后稱重，進行相應的實驗處理。

1.5 取材

各組大鼠在實驗第29天上午8∶00取材。以3.5%濃度的水合氯醛，麻醉處理大鼠；開胸暴露心臟，左心室心尖插入灌注針頭，剪開右心耳，生理鹽水快速灌注后，換4%多聚甲醛的PBS緩沖液緩慢灌注固定；取相應腦組織并放于4%多聚甲醛溶液中固定，30%蔗糖溶液脫水；冰凍切片機切片后，置于-20℃冰箱備用。

1.6 免疫組織化學法

選擇冰凍切片，每組各6張，主要步驟如下：滅活內源性酶，滴加5%BSA封閉液，分別滴加一抗（250倍稀釋的DRD1，50倍稀釋DRD2，50倍稀釋 DAT以及 500倍稀釋TH抗體），37℃水浴箱孵育1 h后，滴加生物素化二抗，孵育 20 min，SABC，37℃水浴箱放置 20 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，封片。光鏡下觀察結果并拍片。免疫組化結果以單個視野下平均光密度IOD（X）表示。

圖2 免疫組化法檢測三組自發性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（ABC 法，200×）

表1 免疫組化法檢測三組自發性高血壓大鼠前額葉皮質TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

表1 免疫組化法檢測三組自發性高血壓大鼠前額葉皮質TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉運體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組10.10±3.25*#7.78±2.73*4.79±2.53 9.06±1.81*#14.20±1.19*17.57±3.74組別 TH DAT 14.67±1.49*11.45±1.42*18.06±2.20 DRD1 14.83±1.84*11.01±1.03*17.83±3.36 DRD2

表2 免疫組化法檢測三組自發性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

表2 免疫組化法檢測三組自發性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉運體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組14.30±3.85*#9.36±2.59*6.30±3.21 9.78±1.24*#14.30±2.43*17.79±2.39組別 TH DAT 14.24±2.19*11.22±2.78*22.10±2.90 DRD1 11.05±1.39*13.83±1.20*16.64±0.72 DRD2

圖3 原位雜交法檢測3組自發性高血壓大鼠前額葉皮質TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（ABC 法，×200）

1.7 原位雜交法

選擇冰凍切片，每組各6張，主要步驟如下：30%H2O2和純甲醇混合液（1︰50，含 0.1%DEPC），室溫固定 30 min；胃蛋白酶消化，暴露mRNA核酸片段，后固定，預雜交，雜交，雜交后洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛標記，SABC，DAB顯色，蘇木素輕度復染、飽和，酒精脫水，二甲苯透明，封片。光鏡下觀察結果并拍片。原位雜交結果以單個視野下平均光密度IOD（X）表示。

1.8 統計學方法

采用SSPS 18.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化法檢測結果

免疫組化法檢測三組SHR大鼠前額葉皮質及紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（圖1、2），采用 Imaga-Pro-Plus 6.0軟件分析，結果以單個視野下平均光密度IOD（X）來表示（表1、2）。

圖4 原位雜交法檢測3組自發性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（ABC 法，×200）

結果表明：在SHR大鼠的前額葉皮質及紋狀體，TH的蛋白表達，孔圣枕中丹組高于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又高于生理鹽水對照組；DAT的蛋白表達，孔圣枕中丹組低于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又低于生理鹽水對照組；DRD1和DRD2的蛋白表達，孔圣枕中丹組和鹽酸哌甲酯組均低于生理鹽水對照組。

2.2 原位雜交法檢測結果

原位雜交法檢測三組SHR大鼠前額葉皮質及紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（圖3、4），采用 Imaga-Pro-Plus 6.0軟件分析，結果以單個視野下平均光密度IOD（X）來表示（表3、4）。

與免疫組化實驗相似：在SHR大鼠的前額葉皮質及紋狀體，TH的基因表達，孔圣枕中丹組高于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又高于生理鹽水對照組；DAT的基因表達，孔圣枕中丹組低于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又低于生理鹽水對照組；DRD1和DRD2的基因表達，孔圣枕中丹組和鹽酸哌甲酯組均低于生理鹽水對照組。

表3 原位雜交法檢測三組自發性高血壓大鼠前額葉皮質TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

表3 原位雜交法檢測三組自發性高血壓大鼠前額葉皮質TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉運體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組23.00±2.10*#19.26±1.26*16.63±3.09 9.32±1.40*#16.45±3.23*26.28±4.48組別 TH DAT 22.54±2.69*16.47±1.25*38.65±1.10 DRD1 14.68±1.03*11.18±1.01*17.44±2.84 DRD2

表4 原位雜交法檢測3組自發性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

表4 原位雜交法檢測3組自發性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉運體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組22.92±1.87*#19.24±0.77*16.47±1.19 11.75±1.99*#17.72±2.77*30.54±9.08組別 TH DAT 17.29±1.27*14.02±1.55*23.12±2.70 DRD1 9.68±1.65*12.70±0.70*17.15±1.05 DRD2

3 討論

迄今為止，腦內多巴胺（DA）功能缺陷是注意缺陷多動障礙（ADHD）發病機制中最有力假說[4]，其中DA對前額葉皮質-紋狀體環路的調控尤為重要，這已得到分子遺傳學和功能腦成像技術等研究結果的證實[5-6]；神經藥理的研究也發現，中樞興奮劑能阻滯突觸前膜上DAT對DA的重攝取作用，從而提高突觸間隙中的DA濃度，并可能促進突觸前的DA釋放[7]。

自20世紀80年代以來，國內中醫藥界的學者開始應用中醫藥治療ADHD。多家報道都肯定了中醫藥治療ADHD的功效。大多數學者認為ADHD的病機特點是陽動有余而陰靜不足，其中腎陰不足，肝陽偏旺為本病最常見證型[8]。既往的文獻研究結果提示，由唐代著名醫家孫思邈所創制的孔圣枕中丹是治療ADHD的基本方劑之一，該方由龜板、龍骨、石菖蒲、遠志四味藥組成，方中龜板、龍骨補腎鎮肝、潛陽安神，遠志交通心腎、強志聰明，石菖蒲散肝舒脾、開竅寧神，諸藥合用，腎陰既補，肝陽得潛，心神安寧，陰陽平和。各地學者的臨床研究都充分肯定了其療效[9]。

本項研究結果發現，在灌服孔圣枕中丹煎液后，SHR大鼠前額葉皮質和紋狀體（含伏核）中DAT的蛋白表達和基因表達均降低，說明孔圣枕中丹下調了腦內DAT的表達，這可能意味著減少了突觸前膜對DA的重攝取作用，從而增加突觸間隙中的DA濃度。另一方面，SHR大鼠在灌服孔圣枕中丹煎液后，其前額葉皮質和紋狀體（含伏核）中的TH蛋白和基因表達上調，鑒于TH是合成包括DA在內的兒茶酚胺（CA）的限速酶，提示孔圣枕中丹可能也促進了腦內的DA合成。這些都有利于改善腦內DA的信號傳導。

研究結果還發現，孔圣枕中丹下調了SHR大鼠前額葉皮質和紋狀體中DRD1的蛋白和基因表達。既往研究發現，實驗大鼠在前額葉皮質定位注入DA的D1受體激動劑Bromocriptine后，其注意缺陷得到顯著改善；相反，注入D1受體拮抗藥SCH23390則出現障礙[10]。有趣的是，激動DRD1改善注意缺陷的效應呈倒“U”型，提示只有適宜水平的刺激效應最大，過高或過低反而加重注意缺陷；哌甲酯被發現能下調突觸后DRD1水平，使DA對DRD1的刺激處于合適水平[11]。所以，筆者推測，孔圣枕中丹下調DRD1可能主要是其提高了突觸間隙DA含量后的負反饋作用結果。此外，SHR大鼠在灌服孔圣枕中丹煎液后，前額葉皮質和紋狀體中DRD2含量也下降。迄今為止，DRD2在ADHD發病中的作用尚不清楚，但有分子遺傳學上的研究結果提示其與ADHD的相關性[12]。不過本研究初步認為，孔圣枕中丹下調DRD2的作用可能與對DRD1的作用類似，也是提高突觸間隙DA含量的負反饋調節所致，這需要進一步的實驗證實。

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