注射D-半乳糖致大鼠衰老效應的評價

王 喆 陸承榮 羅 淵 段連寧 顏克松 戰大偉

1.空軍總醫院臨床航空醫學中心實驗室，北京 100142；2.解放軍總醫院第一附屬醫院實驗動物科，北京 100048

我國正快速進入老齡化社會，據第六次全國人口普查顯示，我國60歲及以上人口已達1.78億，占總人口的13.26%。預計到21 世紀中葉，我國60歲以上老年人將達到4.8億，占總人口的34%。隨著老齡人口的增加，各種老年疾病也隨之而來，如何延緩衰老已成為世界各國學者研究的熱點。因此，研究衰老機制、建立衰老動物模型顯得尤為重要。近年來，我國老年學研究中廣泛將擬自然衰老動物模型應用于衰老機制、衰老過程和抗衰老的研究上，取得了許多研究成果，促進了老年生物學和老年醫學的發展。目前用于衰老研究的動物模型有D-半乳糖衰老模型、自然衰老模型、臭氧損傷衰老模型和去胸腺衰老模型等[1]。在衰老研究上以自然衰老動物模型最為理想，但由于飼養周期長、價格昂貴、動物來源不統一、個體間差異大，從而影響實驗結果的準確性[2]。雖然D-半乳糖在衰老研究方面應用廣泛，但是具體機制還有待進一步證實[3-4]。本實驗對皮下注射和腹腔注射D-半乳糖在動物體內導致的自由基代謝、免疫指標及病理變化進行比較，觀察其擬衰老效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar 大鼠 30 只，體重 250～300 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證為SCXK-（軍）2007-001。動物飼養在屏障系統內，許可證為SYXK-（軍）2007-008。動物適應性飼養1周后，開始正式實驗。

1.2 儀器及試劑

紫外/可見分光光度計，美國Beckman 公司；高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；電子天平，上海電子天平儀器廠。D-半乳糖購自上海第一制藥廠；氯化鈉注射液購自北京雙鶴藥業股份有限公司；D-半乳糖與氯化鈉注射液配成5%D-半乳糖-氯化鈉注射液，使用前配制，常規滅菌后使用；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；甲醛溶液購自北京市旭東化工廠。

1.3 實驗動物分組

30 只大鼠隨機分成對照組、模型1 組和模型2 組，每組各10 只。參照王亞利等[5]、崔美芝等[6]方法進行D-半乳糖衰老模型的建立。模型1 組每天頸部皮下注射D-半乳糖 50mg/（kg·d）；模型 2 組每天腹腔注射 D-半乳糖 500mg/（kg·d）；對照組每天頸部皮下注射等量（50 mg/kg）生理鹽水。各組大鼠均每天上午給藥，連續給藥6周。

1.4 體重、胸腺指數和脾指數測定

每周稱重1次。動物處死后迅速取出胸腺及脾，吸去血液，修去脂肪、系膜。用電子天平稱取胸腺、脾濕重，根據體重計算胸腺指數、脾指數。

1.5 胸腺和脾病理組織變化

胸腺和脾分別稱取濕重后，置于10%中性福爾馬林固定液中固定，行常規脫水，石蠟包埋，組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下進行組織形態學觀察。

1.6 血常規、SOD 活性和MDA 含量測定

動物處死前眼球采血，測定血常規；分離血清，采用化學比色法測定SOD 活性和MDA 含量，方法按試劑盒說明書要求進行。

1.7 統計學方法

采用SPSS 10.0軟件進行統計分析，數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義，以P＜0.01 為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 D-半乳糖對大鼠體重、胸腺指數和脾指數的影響

如表1 所示，與對照組比較，模型1 組和模型2 組大鼠體重增加比例降低，胸腺明顯萎縮，胸腺指數明顯減少（P<0.01），而脾指數增高，但差異無統計學意義（P ＞ 0.05）；模型1 組和模型2 組間各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 D-半乳糖對大鼠體重、胸腺指數和脾指數的影響（±s，n＝10）

表1 D-半乳糖對大鼠體重、胸腺指數和脾指數的影響（±s，n＝10）

注：與對照組比較，*P<0.01

組別 體重增加比例（%） 胸腺指數（10 g/kg） 脾指數（10 g/kg）對照組模型1 組模型2 組34.06 29.46 28.35 0.11±0.02 0.07±0.03*0.06±0.03*0.20±0.03 0.29±0.03 0.27±0.06

2.2 D-半乳糖對胸腺和脾病理組織形態的影響

病理組織觀察顯示，對照組胸腺淋巴細胞結構清晰，細胞密集，染色較深；脾細胞結構正常。模型1 組胸腺皮質明顯變薄、萎縮，細胞排列稀疏，間隙增大，髓質縮小；脾白髓縮小，細胞減少，紅髓擴大并充血。模型2 組胸腺和脾病理變化同模型1 組。說明衰老模型大鼠的胸腺萎縮，脾輕度病理改變。

2.3 D-半乳糖對血常規的影響

如表2 所示，D-半乳糖對血常規無明顯影響，三組血常規各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 D-半乳糖對大鼠血常規的影響（±s，n＝10）

表2 D-半乳糖對大鼠血常規的影響（±s，n＝10）

組 別 血紅蛋白（g/L）紅細胞（×1012/L）白細胞（×1010/L）中性粒細胞（%）淋巴細胞（%）對照組模型1 組模型2 組147.3±8.3 142.8±9.5 143.2±9.6 8.17±0.45 7.76±0.94 7.83±0.92 13.11±1.92 10.38±2.26 10.64±2.31 0.17±0.01 0.15±0.01 0.16±0.01 0.83±0.02 0.85±0.02 0.84±0.02

2.4 D-半乳糖對血清SOD 活性和MDA 含量的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型1 組和模型2 組血清SOD 活性顯著下降（P<0.01），說明自由基代謝出現異常；血清MDA 含量顯著升高（P<0.01），說明D-半乳糖促進機體過氧化產物形成，使動物產生擬衰老效應。

表3 D-半乳糖對大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝10）

表3 D-半乳糖對大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝10）

注：與對照組比較，*P<0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

組別 SOD 活性（NU/mL） MDA 含量（nmol/L）對照組模型1 組模型2 組132.60±16.48 107.97±21.72*108.15±23.26*3.02±0.48 6.58±0.52*6.65±0.73*

3 討論

建立不同的衰老動物模型是常用的揭示衰老機制和抗衰老研究的實驗工具。衰老的機制十分復雜，至今尚未能被充分闡明，而只有研究出生命衰老的機制，才能采取有效的延衰措施，真正延長人類的壽命。當前有關衰老機制的學說多達300多種，其中公認的有免疫學說、自由基學說等[7]。本實驗旨在為免疫衰老和自由基衰老研究方面提供更加完善的實驗依據。隨年齡增長免疫功能出現逐步減退的過程稱為免疫衰老。胸腺作為中樞免疫器官，其功能和狀態直接影響機體的免疫功能，胸腺的增齡性退化是免疫衰老的直接原因[8]。D-半乳糖衰老模型在機體免疫器官的研究中主要涉及胸腺、脾、淋巴結。本實驗結果顯示，衰老大鼠胸腺明顯萎縮，胸腺指數明顯低于對照組，脾指數增高，這與王少康等[9]報道的結果一致。同時病理組織觀察胸腺皮質明顯變薄、萎縮，細胞排列稀疏，間隙增大，髓質縮小，提示D-半乳糖誘導大鼠免疫器官的衰老是引起機體衰老的重要因素。自由基又稱游離基，是具有一個以上的未配對電子的原子或原子團、分子或離子。正常情況下體內自由基的產生和清除保持相對平衡狀態。細胞內自由基的清除主要是抗氧化作用，如SOD 可以清除氧自由基，并有隨增齡而減低的趨勢；自由基的產生可使細胞中的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，脂質過氧化產生的MDA 能與蛋白質結合，使之發生交聯而喪失功能，并形成脂褐素，可以引起機體的衰老與死亡[10]。本實驗結果顯示，D-半乳糖致大鼠的血清SOD 活性下降，MDA 水平升高，說明D-半乳糖進入體內引起的氧自由基代謝失衡是誘發衰老的主要原因。

選用D-半乳糖來建立衰老動物模型常用大鼠和小鼠，由于雄性動物的反應較雌性動物反應敏感，大多選擇雄性動物，以Wistar 大鼠、SD 大鼠、昆明小鼠和ICR 小鼠最常見，沒有種屬、月齡和體重的區別。一般采用頸背部皮下注射和腹腔注射兩種方法，此外，還有口服給藥途徑。李春海等[11]給大、小鼠口服 D-半乳糖 700 mg/（kg·d） 連續6周，可造成較好衰老的效應，與皮下注射 70 mg/（kg·d）連續6周造成的衰老效應相似，但某些生化指標檢測不及皮下注射給藥途徑顯著。有關D-半乳糖誘導劑量和造模時間目前尚無統一規定。根據文獻報道，劑量范圍在50～500 mg/（kg·d）連續 6～8 周給藥比較合適[12]。本實驗采用D-半乳糖 50 mg/（kg·d）頸背部皮下注射和 500 mg/（kg·d）腹腔注射連續6周，試驗效果良好，兩者比較差異無統計學意義（P<0.05）。同時在造模過程中應注意給藥時間應準時，D-半乳糖溶液需密封保存，防止發生變質，并根據動物體重變化調整D-半乳糖注射劑量，注射時采取無菌操作，避免引起大鼠因感染而死亡。

綜上所述，采用D-半乳糖頸背部皮下注射和腹腔注射兩種方法所致大鼠衰老的效應，具有效果相近、檢測指標顯著、簡便易行、價格低廉、結果穩定的特點。

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