苦碟子對高同型半胱氨酸血癥細胞凋亡的影響

胡德奇 孫 倩 張建軍 宋光熠

遼寧省基礎醫學研究所，遼寧沈陽 110101

大量研究表明，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）引發動脈粥樣硬化及相關心腦血管疾病的病理生理機制十分復雜[1-2]。目前，HHcy 動物模型的復制有多種方法。本實驗研究采用大鼠灌胃給予蛋氨酸的方法復制HHcy 動物模型，檢測動脈硬化的相關指標，并對葉酸+VitB12及苦碟子干預其動脈平滑肌凋亡的作用進行藥效學研究。現將研究結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物為體重120～150 g 的Wistar 雌性大鼠，購于沈陽醫學院實驗動物中心[SCXK（遼）2003-0016，遼寧省科學技術廳簽發]。動物飼料為繁殖鼠全價顆粒飼料，由沈陽市于洪區前民飼料廠生產。VitB12，山西云鵬制藥有限公司生產（批號：20061107）；葉酸，天津飛鷹制藥有限公司生產（批號：20060408）；蛋氨酸粉劑，吉林農業大學提供；同型半胱氨酸（Hcy）、Caspse-3 酶聯免疫吸咐（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、TUNEL 檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；苦碟子注射液，通化華夏藥業有限公司生產（批號：060506）。

1.2 實驗方法

雌性Wistar 大鼠28 只在實驗室適應性飼養1周后，隨機分為4 組，模型組（n=8）給予0.75 g/kg 蛋氨酸灌胃，每天2次；苦碟子組（n=6）給予 0.75 g/kg 蛋氨酸灌胃，每天2次，同時給予7.5 mL/kg 苦碟子注射液灌胃，每天1次；葉酸+VitB12組（n=7）給予0.75 g/kg 蛋氨酸灌胃，每天2次，同時分別給予2.5 mg/kg 葉酸、10 μg/kg VitB12 灌胃，每天1次；空白對照組（n=7）每天給予等容積生理鹽水灌胃。連續給藥10周后將動物處死，分別取血并分離血漿，ELISA 法檢測血漿Hcy、Caspse-3 水平。取胸主動脈并以2.5%戊二醛固定，分別在光學顯微鏡、電子顯微鏡下檢查其病理改變。TUNEL 法檢測胸主動脈平滑肌陽性細胞計數，正常細胞核均勻著藍綠色，凋亡細胞核呈深淺不一的棕黃色。于電子顯微鏡下隨機選取1個視野，計數視野中血管中膜細胞TUNEL 染色陽性細胞數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 10.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

與空白對照組比較，模型組大鼠血漿Hcy 明顯升高，TUNEL 胸主動脈平滑肌陽性細胞計數增多，血漿Caspse-3含量升高（均P<0.01），提示Wistar 雌性大鼠灌胃給予蛋氨酸0.75 g/kg，每天2次，連續10周可誘發HHcy。與模型組比較，藥物干預各組TUNEL 胸主動脈平滑肌陽性細胞計數減少，血漿Caspse-3 含量降低（均P<0.01）。葉酸+VitB12組血漿Hcy 濃度下降，與模型對照組比較，差異有高度統計學意義（P<0.01）。見表1。光學顯微鏡顯示：模型組大鼠血管壁的病理改變為內皮損傷，平滑肌增生，在內膜下及平滑肌有炎性細胞浸潤；空白對照組大鼠血管壁未見病理改變；藥物干預各組內皮損傷、血管平滑肌增生和炎性細胞浸潤程度均較模型組大鼠明顯減輕。電子顯微鏡顯示：模型組大鼠病理改變為血管平滑肌細胞腫脹十分明顯，內質網呈擴張狀態，線粒體水腫，溶酶體明顯增多；葉酸+VitB12組、苦碟子組及空白對照組均未見上述改變。

表1 各組大鼠血漿Hcy、Caspse-3、TUNEL胸主動脈平滑肌陽性細胞計數（±s）

表1 各組大鼠血漿Hcy、Caspse-3、TUNEL胸主動脈平滑肌陽性細胞計數（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；Hcy：同型半胱胺酸

組別例數 Hcy（μmol/L）Caspse-3（μg/L）TUNEL 胸主動脈平滑肌陽性細胞計數（個）模型組空白對照組葉酸+VitB12 組苦碟子組8776 115.04±10.97 6.98±2.09*17.46±6.13*116.27±14.54 1.31±0.12 1.02±0.07*1.09±0.13*1.16±0.12*17.68±2.41 2.86±0.89*5.71±2.47*10.00±3.32*

3 討論

大量研究表明，Hcy 可能是通過誘導內皮功能紊亂、血管平滑肌增生、促進脂蛋白氧化、增加血小板活性、增加膠原蛋白合成導致動脈粥樣硬化[3]。近年研究表明，細胞凋亡亦是Hcy 致動脈粥樣硬化的機制之一，Hcy 可促進內皮細胞及血管平滑肌凋亡，并且呈濃度依賴性關系[4]。在正常血管和動脈粥樣硬化各個階段血管平滑肌都存在凋亡，但動脈粥樣硬化的血管平滑肌凋亡數量較正常血管明顯增加[5-7]。本實驗證實，Hcy 可引發動脈粥樣硬化促進大鼠血管平滑肌凋亡，葉酸+VitB12和苦碟子可降低血漿Caspse-3含量，抑制血管平滑肌凋亡。葉酸、VitB12抑制血管平滑肌凋亡可能與降低血漿Hcy 含量進而抑制其病理過程密切相關。苦碟子對Hcy 的代謝無明顯影響，但對HHcy 的影響是多方面的，其具有抗過氧化、抑制細胞因子異常分泌等作用[8-10]，其抑制Caspse 依賴性的細胞凋亡機制可能與上述作用有關，但相關的信號傳導途徑有待進一步研究。

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