糖尿病合并冠心病患者血紅素氧化酶-1基因多態性的表達及其意義

羅順祥 徐尚華 張 虹 鐘文亮 吳艷晴

1.福建醫科大學附屬南平市第一醫院心內科一區，福建南平 353000；2.福建醫科大學附屬南平市第一醫院骨科一區，福建南平 353000

糖尿病血管病變是嚴重影響糖尿病患者生命質量及致死、致殘的主要原因。但臨床上發現糖尿病患者冠心病的發生與血糖水平并不相關，英國前瞻性糖尿病研究（UKPDS）亦證明單純血糖控制并不能達到減少糖尿病大血管合并癥的目的。高血糖引起的氧化應激是糖尿病動脈粥樣硬化發生的主要原因，抗氧化可延緩動脈粥樣硬化的發生。血紅素氧化酶-1（HO-1）是細胞保護蛋白，它分解血紅素產生的一氧化碳（CO）、游離鐵和膽紅素，具有抗氧化、抗炎作用，可保護血管免受氧化應激及炎癥介質的損傷[1]。HO-1 基因啟動子區內包含著一個由GT 二核苷酸重復組成的（GT）n 短串聯重復序列（STR）多態性，人 HO-1 基因啟動區所特有微衛星結構的 （GT）n 長度直接影響HO-1基因的轉錄水平，HO-1 啟動子區GT 短重復序列人體內的HO-1 表達水平更高[2]。本課題探討2型糖尿病（T2DM）患者HO-1 基因多態性、單核細胞中HO-1 的表達水平，評價HO-1 基因多態性及HO-1 表達水平與冠心病的相關性，為進一步研究如何調節HO-1 的表達，從而應用于臨床治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2008年6月～2011年10月，選擇在福建醫科大學附屬南平市第一醫院住院經冠狀動脈造影證實合并有冠心病的糖尿病患者62例作為冠心病組，其中，急性心肌梗死2例，陳舊性心肌梗死5例，不穩定型心絞痛20例，穩定型心絞痛35例；另選擇性別、年齡與冠心病組相仿，經冠脈造影證實無冠脈明顯狹窄的單純糖尿病患者59例作為對照組。其中，冠心病組62例，男35例，女27例，平均年齡（62.0±3.2）歲，合并高血壓 30例、吸煙 17例；對照組 59例，男 31例，女28例，平均年齡（63.0±2.9）歲，合并高血壓36例、吸煙18例。兩組年齡、性別、吸煙、體重指數（BMI）、血壓、空腹血糖（FPG）、餐后 2 h 時血糖（2 h PG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平比較，差異均無統計學意義（均P>0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 體檢和生化檢查 所有患者入院后測量身高、體重、腰圍、臀圍和血壓，計算BMI。禁食10 h 后采空腹靜脈血，測定血常規、TC、LDL-C、FPG、HbA1c及 2 h PG。

1.2.2 冠狀動脈造影檢查 利用飛利浦公司DSA，采用經橈動脈或股動脈穿刺法進行冠狀動脈造影，對每支血管進行最佳的多體位造影，以直徑狹窄百分數對其進行評估。有一條主要冠狀動脈直徑狹窄百分數>50%診斷為冠心病，冠狀動脈直徑狹窄百分數<20%為正常。

表1 冠心病組和對照組基本資料比較（±s）

表1 冠心病組和對照組基本資料比較（±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa

組別例數 性別（男/女，例）年齡（歲）吸煙[n（%）]體重指數（kg/m2）收縮壓（mm Hg）舒張壓（mm Hg）空腹血糖（mmoL/L）餐后2 h 血糖（mmoL/L）糖化血紅蛋白（%）總膽固醇（mmoL/L）低密度脂蛋白膽固醇（mmoL/L）冠心病組對照組62 59 35/27 31/28 62.0±3.2 64.0±2.9 17（27.4）18（30.5）24.6±3.7 23.7±3.5 138.5±24.5 132.8±23.1 81.6±18.4 82.3±16.5 6.7±1.3 7.1±1.0 10.4±1.8 9.8±1.6 6.7±1.6 7.0±1.4 5.20±1.04 4.95±0.73 3.56±0.49 3.29±0.57

1.2.3 HO-1 啟動子區 （GT）n 檢測及分型 采用熒光標記PCR 以及毛細管電泳相結合技術進行基因分型。取研究對象外周抗凝血5 mL，分離淋巴細胞和單核細胞。分離單個核細胞后，采用QIAGEN 試劑盒提取細胞基因組DNA。primer5.0軟件設計擴增啟動子區引物。引物序列如下：正向 ：5'-GGATTCCAGCAGGTGACATT-3'；反 向 ：5'-ACAGCTGATGCCCACTT TCT-3'。25 ML 體系PCR 擴增，PCR 擴增條件：94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，循環 35次，最后 72℃延伸 10 min。PCR 產物純化后采用ABI 公司3730 進行毛細管電泳，run 3730 data collection v2.0 收集毛細管電泳熒光信號，GeneMapper Software v3.5軟件對峰圖進行分型（重復次數），確定（GT）n多態性的多態。（GT）重復次數＜27，為 S 等位基因，（GT）重復次數≥27，為 L 等位基因，分別構成 SS、SL、LL 這3種基因型[3]。

1.2.4 Western blot 測HO-1 的表達 應用單去污劑裂解液提取單個核細胞蛋白質，利用BCA 法測定蛋白含量，以每孔50 μg 蛋白量加樣，穩壓125 V 在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再進行蛋白質的電轉移（轉移槽50 V 轉膜1 h）。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。將膜分別與一抗、二抗反應（HO-1 一抗稀釋度 1∶500，β-actin 一抗稀釋度 1∶1000，二抗稀釋度1∶500，室溫下反應2 h）。免疫反應后將膜蓋于發光試劑（北京中杉試劑公司）上反應1 min，暗室曝光3～5 min，X線片經顯影、定影后待檢。結果掃描進計算機，用Image-Pro-Plus 自動圖像分析軟件（Version：4.5）對HO-1 光帶進行分析，以HO-1 蛋白帶的灰度峰值代表HO-1 的表達量[4]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冠心病組與對照組（GT）n 重復序列的多態分布

在研究人群中，HO-1 基因的啟動子區 （GT）n 呈高度多態性，（GT）n 重復次數為14～39次，在所有研究對象及兩組內均呈雙峰分布，23次和30次頻率最高，（GT）n 重復次數在各組中的分布頻數見圖1。按文獻[3]報道，將HO-1基因的啟動子區 （GT）n多態性分為2個等位基因：GT 重復次數＜27次為短重復序列（S 等位基因），GT 重復次數≥27次為長重復序列（L 等位基因）。冠心病組的短重復序列（S 等位基因）明顯少于對照組（P＜0.01）。所有患者因此分為攜帶SS、SL、LL 基因型3種。冠心病組HO-1 基因啟動子區 （GT）n 重復序列基因型分布為：SS型15例，SL型16例，LL型31例；對照組分別為SS型26例，SL型16例，LL型17例，兩組基因型分布存在明顯差異，冠心病組短重復序列SS型明顯少于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組等位基因及基因型的分布（例）

圖1 （GT）n重復次數在兩組的頻數分布

2.2 Western blot 測HO-1 蛋白表達水平

冠心病組患者HO-1 蛋白表達明顯低于對照組，分別為（10.5±1.6）、（15.6±2.2），差異有高度統計學意義（P ＜ 0.01）。見表3。

表3 兩組血紅素氧化酶-1蛋白表達水平比較

3 討論

HO-1 是一種誘導性細胞保護酶，它分解血紅素產生的CO、游離鐵和膽紅素，具有抗氧化、抗炎作用，可保護血管免受氧化應激及炎癥介質的損傷[1]。HO-1 基因啟動子內存在GT 雙核苷酸重復序列，其5′端區域（GT）n 重復序列具有高度多態性，（GT）n 重復次數對HO-1 的基因轉錄產生不同的調節作用。依照重復次數分為S型（n＜27）和L型（n≥27），從而產生 SS、SL、LL 3種基因型。已有的研究發現HO-1 基因多態性與冠狀動脈斑塊負荷相關，具有L 基因型的患者較S 基因型的斑塊負荷明顯加重[5]。而王迎洪等[6]的研究進一步發現HO-1 基因多態性與冠心病冠脈病變程度相關，LL 基因型頻率分布在多支血管病變組較單支和雙支血管病變組高。但目前對于上述研究結果卻存在爭議，在L üblinghoff 等[7]的研究中發現HO-1 基因多態性與冠心病及心肌梗死的發生并無相關性。在本研究中發現，糖尿病患者冠心病組短重復序列（S 等位基因）明顯少于對照組（P＜0.01），冠心病組基因型主要以LL型和SL型為主，對照組主要以SS型和SL型為主，兩組基因型分布存在明顯差異，冠心病組短重復序列SS型明顯少于對照組（P＜0.05）。因此本研究認為，在糖尿病人群中，HO-1基因多態性與冠心病發病相關，相對于短重復序列（S 等位基因）者，長重復序列（L 等位基因）者為冠心病易感人群。

既往研究表明，短（GT）n 雙核苷酸串聯重復序列（n＜27次）使HO-1 表達含量上調，發揮抗氧化應激、抗炎癥損傷、抗細胞凋亡作用，保護冠狀動脈血管內皮細胞[8]。而長串聯重復序列導致HO-1 轉錄水平下降，對血管內皮細胞的保護作用減弱[9]。李瑩等[10]的研究證實在急性冠脈綜合征患者HO-1 表達水平與冠狀動脈病變程度相關，冠脈病變程度越重其HO-1 表達水平越低。在本研究中，冠心病組與對照組相比其血壓、血脂、血糖及吸煙等均無明顯差異，但冠心病組HO-1 表達水平較對照明顯降低 [（10.5±1.6）和（15.6±2.2）]（P ＜ 0.01）。進一步證實，在糖尿病人群，擁有長重復序列（L 等位基因）患者，其HO-1 表達水平明顯減低，更易發生冠心病。

綜上所述，本研究結果提示，在糖尿病人群中，HO-1的基因多態性與冠心病易感相關，擁有長重復序列（L 等位基因）者HO-1 表達水平較擁有短重復序列 （S 等位基因）者明顯減低，為冠心病易感人群。基因型分析可以預示個體冠心病易感性，但冠心病為因素交互作用所致，須做到早期綜合防治。

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