缺血預處理通過抑制白三烯C4生成減輕大鼠肝缺血再灌注損傷*

洪芬芳， 張大雷， 涂桂林， 郭發先， 楊樹龍△

(南昌大學1基礎醫學院生理教研室，2醫學實驗教學部，江西南昌330006)

肝臟缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是一個重大臨床問題［1-2］，在創傷、熱損傷、血容量減少、內毒素休克、重建血管外科、肝移植和肝腫瘤切除外科手術中均存在I/R損傷［3］。白三烯(leukotrienes，LTs)是經 5-脂氧化酶(5-lipoxygenase，5-LO)途徑產生的一類重要前炎癥花生四烯酸類物質。LTs包括半胱氨酰白三烯 (cysteinyl leukotrienes，Cys-LTs;包括LTC4、LTD4和LTE4)以及白三烯 B4(LTB4)。Cys-LTs母體復合物LTC4由肝微粒體白三烯C4合酶(leukotriene C4 synthase，LTC4S)、谷胱甘肽S轉移酶(microsomal glutathione S-transferase，mGST)2和mGST3催化LTA4和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)結合而成［4-5］。不斷增加的證據提示肝臟I/R損傷病理機制中涉及LTs［3］。我們的結果［3］也顯示肝臟I/R早期LTC4產物增加可能與膜脂質過氧化以及肝臟功能和形態組織損傷使LTC4代謝產物的排泄減少有關，而LTC4的積聚可能加重肝臟I/R損傷導致的業已存在的炎癥損傷。缺血預處理(ischemic preconditioning，IP)是指肝臟短暫缺血事件能對隨后的長時間I/R損傷產生保護并提高其再生能力［6］。一系列證據表明IP在肝移植等涉及I/R損傷過程中具有保護作用［7-8］。但存在一些矛盾的報道［9-10］，且IP減輕肝臟I/R的機制尚未完全闡明［7］。至今未見有關IP減弱大鼠肝I/R損傷會否涉及LTC4生成的研究報道。

材料和方法

1 材料

雄性SD大鼠(250～300 g)18只，由南昌大學實驗動物中心提供。LTC4和前列腺素B2(prostaglandin，PGB2)均購自Cayman。血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspertate aminotransferase，AST)活性和肝組織GSH檢測試劑盒系南京建成公司產品。

2 方法

2.1 肝I/R損傷動物模型建立 成年雄性SD大鼠18只(平均每組6只)，隨機分為以下3組進行實驗。(1)肝臟I/R組:按文獻［3］所述采用 Pringle’s操作方法制作大鼠肝臟I/R損傷模型。戊巴比妥鈉40 mg/kg ip麻醉后固定，無菌條件下使用內徑0.9 mm聚乙烯管行頸靜脈插管以便抽血和補液，腹部正中切開，用無創傷動脈夾夾閉供應肝左、中葉的動靜脈60 min再灌流5 h制成I/R損傷模型;再灌注5 h處死動物，采血并速取肝左葉置液氮中凍存并轉至-80℃冰箱儲存以備檢測，取0.5 g肝組織加4.5 mL生理鹽水勻漿離心并保存-80℃待測，另取肝中葉組織制備肝微粒體和少量組織用甲醛緩沖液固定做免疫組化或蘇木精和曙紅染色進行組織病理學檢查。(2)假手術對照組:只麻醉開腹，不阻斷肝臟血流。(3)IP組:以短暫10 min缺血再灌注10 min作為IP處理，之后開始較長時間60 min缺血和5 h再灌注。

2.2 肝組織LTC4含量的檢測 按文獻［3］，采用反相高效液相色譜法(reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)測定各實驗組肝組織中LTC4含量。

2.3 血清ALT、AST活性和肝組織GSH含量檢查使用試劑盒，根據制造商的說明采用分光光度計測定血清ALT和AST的活性和肝組織中GSH含量。

2.4 組織學檢查 在室溫用10%甲醛固定肝臟組織，石蠟包埋，制作5 mm的切片，用蘇木精伊紅染色，光鏡下檢查肝臟組織結構損傷情況。

3 統計學處理

數據以均數 ±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0軟件分析。組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 IP對肝臟I/R期間LTC4含量的影響

與對照組相比，I/R組肝組織中LTC4含量顯著增加(P＜0.01)，IP組未見明顯變化(P＞0.05);而與I/R組相比，IP組肝臟LTC4水平顯著降低(P＜0.05)，見圖1。

2 IP對大鼠肝I/R損傷期間血清ALT和AST活性以及肝組織GSH含量的影響

如表1所示，I/R和IP組血清ALT和AST值均高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。與I/R組相比，IP顯著降低血清ALT和AST水平(P＜0.01或P＜0.05)。I/R組中肝組織GSH含量低于對照組(P＜0.05)，與I/R組相比，IP處理增加肝組織GSH含量(P ＜0.05)。

3 病理檢查結果

再灌注5 h后肝臟可見明顯結構損傷和局灶性壞死，IP組僅有較小結構損傷，對照組顯示正常的肝組織結構，見圖2。

討 論

Figure 1.HPLC chromatograms demonstrating LTC4 content in rat liver tissues.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs I/R.圖1 各組大鼠肝組織LTC4含量的變化

I/R損傷被認為參與了肝切除術或移植后肝功能衰竭的發病機制，可能引發全身炎癥反應，并導致多器官功能障礙綜合征。大量的實驗和臨床研究表明，IP在防止肝I/R損傷發展方面有較好的作用。但IP減輕肝I/R損傷的確切機制仍未完全闡明。進一步了解IP保護機制，將促進其在肝移植等治療方面的應用，加速I/R肝損傷替代治療。

LTs是作用廣泛的炎癥介質，參與了多種肝功能和肝臟疾病的生理和免疫反應。不斷增加的證據表明 LTs涉及肝 I/R 損傷的病理生理機制［3，11-12］，尚缺少肝I/R損傷期間IP關聯LTs的報道，包括IP對LTC4S蛋白表達、LTC4合成酶的活性，以及LTC4生成的影響。本實驗中I/R大鼠肝組織中LTC4生成增加，與以前的報道一致［3，11］，此外，我們首先發現，IP處理顯著減少I/R損傷肝臟LTC4生成，可能是IP防治肝臟I/R損傷的原因之一。

表1 對照組、I/R和IP組大鼠血清ALT和AST活性以及肝組織GSH含量的變化Table 1.Changes of serum ALT and AST activity and liver GSH level in rats of control，I/R and IP groups(mean±SD.n=6)

Figure 2.Rat liver histological changes in control(A)，I/R(B)and IP(C)groups after 5 h of reperfusion following 60 min of hepatic ischemia(HE staining，×200).圖2 對照組、I/R和IP組大鼠肝I/R損傷早期組織形態學的變化

已知肝臟是參與系統起源的花生四烯酸產物降解和消除的一個主要器官［13］，Cys-LTs和LTB4均在肝臟經ω-氧化和β-氧化降解，此降解途徑在肝硬化和肝腎綜合征時發生了改變［11，14］。研究表明［3，15］，在病理條件下LTs生成增加，可參與對肝細胞直接損傷。本研究中，盡管與對照組相比，IP處理增加了血清ALT和AST的活性，但這些值在IP組均明顯低于I/R組。同時，I/R損傷大鼠存在肝結構損傷和一些壞死，而IP減弱了I/R造成的肝損傷。此外，I/R降低而IP增加了肝組織GSH水平。這些結果顯示，IP處理可以明顯改善再灌注早期肝功能和結構，并抑制氧化應激反應，表明IP可能部分通過改善I/R損傷大鼠肝臟分泌排泄LTC4的功能，減少LTC4堆積，保護I/R損傷的肝臟。

總之，我們的研究結果表明，在大鼠肝缺血60 min再灌注5 h后，IP減少了肝LTC4生成，同時伴隨有肝酶釋放減少和肝組織結構改善，以及氧化應激反應的降低，表明IP降低LTC4生成可能涉及其在肝臟I/R期間的保護作用機制。本研究將進一步加深對IP誘導器官耐受性的理解，并推動其在肝移植治療中的應用。

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