bFGF對人臍帶間充質干細胞增殖及膠原產生的影響*

林 麗， 林紹強， 王曉玉△， 張 羨

(1暨南大學附屬第一醫院婦產科，廣東廣州510632;2溫州醫學院藥學院生物制藥系，浙江溫州325035)

目前間充質干細胞因其強大的分化潛能已經成為科學家們研究的熱點，間充質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)在組織工程領域顯示出了良好的應用前景［1-2］。相比其它間充質干細胞，本實驗選用的人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有種子細胞的很多優良特性，如增殖活性高、免疫原性低、無致瘤性等，來源充足，無倫理問題［3］。國外有研究證實，堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有顯著的促 MSCs增殖作用［4］。但對hUCMSCs的增殖是否同樣具有促進作用，對hUCMSCs產生膠原的能力有何影響，是否會加重創面修復過程中瘢痕組織的形成等問題，尚不明確。本實驗擬采用bFGF對hUCMSCs在體外條件下進行干預培養，研究其對hUCMSCs增殖和I、III型膠原產生的影響，初步探討兩者聯合應用是否有促進組織修復、減少瘢痕形成的作用。

材料和方法

1 原代hUCMSCs的分離和培養

正常、足月、剖宮產的健康嬰兒臍帶，取自暨南大學附屬第一醫院手術室，經產婦知情同意，實驗經醫院倫理委員會批準。手術前產婦按常規做艾滋病病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體等檢測。將臍帶標本采集后于4℃保存，4 h內完成實驗。臍帶在含青霉素和鏈霉素的PBS溶液中洗盡殘余血液，剔除臍帶中的血管并剪碎至1～2 mm，酶消化法分離細胞。24 h后除去非貼壁細胞，按實驗要求隨機分成實驗組和對照組，換置成相應的新鮮培養液培養，每3 d更換1次培養液，待貼壁細胞即將鋪滿瓶底時用胰酶消化分離，按5×103/cm2密度接種于25 cm2培養瓶，記為 P1;待培養過程中貼壁細胞彼此融合，鋪滿整個培養板的底面時，再重復以上操作，記為 P2;以此類推傳代培養。

2 流式細胞術分析其表面標記

用流式細胞術分析細胞表型以證實我們分離的是間充質干細胞，而不是造血、內皮類細胞。取第2代hUCMSCs，消化后計數2×105細胞與抗體室溫反應30 min，流式細胞儀分析細胞表型。

3 hUCMSCs成脂誘導分化及油紅O染色

取 P3 hUCMSCs，加入含 10－6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、10 mg/L 胰島素、1×105U/L青霉素和100 mg鏈霉素的DMEM/F12培養液，置于含有5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養，每3 d進行細胞換液1次，連續誘導2周，采用油紅O染色鑒定。

4 hUCMSCs成骨誘導分化及茜素紅染色

取 P3 hUCMSCs，加入含10－7mol/L地塞米松、10 μmol/L β-甘 油 磷酸 鈉和 10 mg/L 胰島 素 的DMEM/F12培養液，置于含有5%CO2、37℃、飽和濕度培養箱中培養，每2～3 d進行細胞換液1次，連續誘導3周，采用茜素紅染色鑒定細胞分化為成骨細胞的能力。

5 bFGF濃度的確定

取P2 hUCMSCs，以添加不同濃度bFGF的普通培養基培養，設含 10 μg/L、20 μg/L 和 30 μg/L 組，對照組為無bFGF培養，每組調整細胞濃度為3×103cells/well，分別接種于7塊96孔板內，每組6孔，依次于培養第1～7 d消化細胞，計數。以細胞數為縱坐標，天數為橫坐標，繪制生長曲線。取促進hUCMSCs增殖的最適濃度。

6 培養液成分及實驗分組

培養液選用 DMEM/F12(Gibco)，添加1×105U/L青霉素(HyClone)和100 mg/L鏈霉素(Hy-Clone)，使用前加入10%胎牛血清(HyClone)。依據培養液中是否含有bFGF，實驗分為2組:實驗組使用含bFGF(Sigma)的培養液;對照組培養液不含bFGF。

7 MTT比色法分析2組 hUCMSCs的存活和增殖能力

使用二甲基四氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)測定A值，間接反映細胞生長及增殖活性。將生長良好的P2 hUCMSCs以2 000 cells/well種植在7塊96孔培養板中，加入2種不同的培養液，采用bFGF對hUCMSCs進行干預培養，并設實驗組(加bFGF)和對照組(無 bFGF)，依次于培養 2、4、8、12、14 d后，于各小孔內加入5 g/L噻唑藍20 μL，繼續培養4 h后每孔加入二甲基亞砜200 μL，用酶標儀在570 nm波長下檢測hUCMSCs增殖情況，并繪制生長曲線。

8 RT-PCR測定其對膠原產生的影響

RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白mRNA的表達:取P4 hUCMSCs，實驗組及對照組各培養30 d后，以Trizol法提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測總RNA的純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。取總RNA 0.4 μg反轉錄為 cDNA，樣品－20℃保存。PCR引物由上海捷瑞生物有限公司合成，見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences for the primers

PCR反應條件:94℃預變性5 min，94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共40個循環;最后72℃ 5 min，4℃終止反應。以2%瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液中電泳進行PCR產物鑒定，用基因條帶圖像處理系統，將電泳結束后的凝膠塊放入紫外投射儀的暗箱內，將β-actin的密度值設定為1，目的基因條帶密度相對于β-actin的比值即為目的基因的相對密度，測量3次，取平均值。

9 Western blotting檢測I、III型膠原蛋白的表達

hUCMSCs貼壁培養30 d后，實驗組培養液中含bFGF(20 μg/L)，對照組無 bFGF，分別取 P4 細胞各2瓶，采用Western blotting方法測定 I、III型膠原蛋白的表達。以ImageJ圖像分析系統對各條帶進行灰度分析，以GAPDH為內參照。

10 統計學處理

用SPSS 13.0軟件處理 ，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩樣本均數比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 hUCMSCs的形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察，實驗組貼壁細胞數量較對照組多，1周后可見多數呈長梭形或扁平形的成纖維樣細胞;實驗組傳代時間快，傳代間隔小于對照組，當第1代hUCMSCs細胞生長到匯合期時，實驗組細胞數是對照組的2.5倍，見圖1。

2 流式細胞術分析其表面標記

培養的2組hUCMSCs均表現為CD29和CD105強陽性，不表達 CD34、CD45和 HLA-DR。CD34、CD45和HLA-DR呈陰性，說明實驗所分離培養的細胞具有間充質干細胞的表型特征，見圖2。

3 成脂細胞和成骨細胞分化鑒定結果

向成脂細胞培養誘導分化后，多數細胞失去原有的長梭形而變為肥大、扁平的多角形細胞，2周后用油紅O染色檢測脂肪滴為陽性;在細胞向成骨細胞誘導3周后茜素紅染色陽性，細胞內可因鈣質沉積而顯現紅色，見圖3。

Figure 1.The cell morphology and growth after treatment with bFGF(20 μg/L).圖1 2組細胞的形態和生長狀況

4 加入不同濃度bFGF培養的hUCMSCs的生長曲線

加入bFGF后，前3 d不同濃度的bFGF對hUCMSCs增殖的影響不明顯，4 d后細胞增殖明顯，6 d到達高峰，30 μg/L、20 μg/L 和 10 μg/L bFGF 組的細胞數分別為13.6 ×103、13.43 ×103和9.33 ×103，經統計學檢驗分析顯示，20 μg/L、30 μg/L 與10 μg/L比較有顯著差異(P ＜0.05)，20 μg/L 與 30 μg/L組比較無顯著差異(P ＞0.05)，10 μg/L、20 μg/L 組與對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，見圖4。上述結果提示選取20 μg/L是促進hUCMSCs增殖的最佳濃度，與相關文獻報道一致。

5 實驗組與對照組hUCMSCs的MTT結果及生長曲線

依據MTT測定結果，繪制實驗組和對照組細胞生長曲線，見圖5。2組之間吸光度值比較差異有顯著性(P＜0.05)。接種后第1 d 2組細胞生長相對平緩，表現同生長曲線潛伏期。第4 d起2組保持較高的增殖活性，呈快速生長，構成生長曲線的指數增長期，實驗組細胞增殖明顯。2組細胞相比:實驗組A值明顯增加(P ＜0.05)。

Figure 2.Flow cytometry analysis of the surface markers on hUCMSCs.圖2 流式細胞術分析hUCMSCs的表面標記

Figure 3.Oil red O and alizarin red staining of hUCMSCs.圖3 hUCMSCs的油紅O染色及茜素紅染色

Figure 4.Growth curves of hUCMSCs stimulated with different concentrations of bFGF圖4 不同濃度bFGF作用hUCMSCs的生長曲線

Figure 5.Growth curves of control group and bFGF(20 μg/L)treatment group.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖5 bFGF干預后2組hUCMSCs的生長曲線

6 RT-PCR測定2組hUCMSCsⅠ、III型膠原mRNA表達的變化

經bFGF處理的細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達情況見圖6。2組間Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達差異有統計學意義(P＜0.05)，實驗組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達明顯低于對照組。

7 Western blotting的檢測結果

實驗組與對照組相比，I、III型膠原蛋白表達減少，且差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖7。

討 論

Figure 6.Effects of bFGF on collagen I and III mRNA expression in hUCMSCs.hUCMSCs were treated with 20 μg/L bFGF for 30 d.M:DNA marker;1，2，3:bFGF group;4，5，6:control group;1，4:collagen I;2，5:collagen Ⅲ;3，6:β-actin.Mean ± SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖6 RT-PCR檢測 bFGF對 hUCMSCs I、III型膠原 mRNA表達的影響

本實驗所培養的P2 hUCMSCs的流式細胞術檢測結果顯示:2組 hUCMSCs均表現為 CD29和CD105強陽性，CD34、CD45和HLA-DR陰性。不表達造血干細胞及血管內皮細胞的表面抗原標志CD34、白細胞抗原CD45，證明其為非造血、非內皮類細胞［5］;HLA-DR陰性說明該細胞免疫原性很低。因此，本次實驗所分離培養的細胞具有間充質干細胞的表型特征。成脂及成骨分化成功提示我們分離培養的是間充質干細胞，可以滿足向成肌細胞誘導的需要。有大量國內外研究證實MSCs能分化為心肌細胞，分化的細胞具有相似的動作電位和形成閏盤結構［6］，可應用于改善肌原性心衰。我們已成功地將hUCMSCs注射于壓力性尿失禁的大鼠尿道周圍，并觀察到其存活、增殖，改善了尿失禁的體征，形態學上觀察可以修復尿道周圍的支持結構，但在盆底器官中的應用未見報道。有學者將hUCMSCs注射進脛前肌，脛前肌預先用布比卡因損傷，在體內微環境誘導下，hUCMSCs體內存活2周后分化為骨骼肌細胞，見受損的肌肉完全修復［7］。

Figure 7.Effects of bFGF on collagen I and III protein expression in hUCMSCs.hUCMSCs were treated with 20 μg/L bFGF for 30 d.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖7 Western blotting檢測bFGF對 hUCMSCs I、III型膠原蛋白表達的影響

近年來的研究發現，bFGF對干細胞的增殖具有重要的促進作用。bFGF是一種作用較廣泛的細胞因子，它是一種強絲裂原，對來源于中胚層和外胚層的組織具修復和再生作用，可促進造血干細胞、神經干細胞、胚胎干細胞增殖。Akino等［8］發現在bFGF單獨作用或合用2 d后，體外培養的人間充質干細胞的細胞數與對照組相比有顯著增長(P＜0.05)，顯示了bFGF促MSCs的增殖的作用。雷軍等［9］研究了bFGF、IL-1α、IL-3、IL-6 等因子對人骨髓間充質細胞增殖的作用，發現bFGF促增殖作用最顯著。本實驗亦證實了bFGF濃度為20 μg/L對體外培養的HUCMSCs具有很明顯的促進增殖的作用，與文獻報道一致。增加bFGF濃度并不能進一步發揮促增殖作用，其機制可能是bFGF與hUCMSCs表面的受體結合，通過胞內轉導通路發揮促增殖作用，因受體數量有限，當bFGF達到一定濃度時受體飽和，此時繼續增加濃度但促增殖作用不再增強。

有研究已證實了bFGF具有促損傷修復的作用［10］。Nakagawa等［11］合用 hMSCs和 bFGF 作用于裸鼠的皮膚損傷，傷口面積明顯縮小(P＜0.01)，表明hMSCs與bFGF合用可加快皮膚創面愈合。Anna等［12］用大鼠建立動物模型，用 bFGF作用培養后的自體同源肌細胞注入大鼠損傷的尿道壁，2周后發現，實驗組大鼠尿道移植區細胞的數量比對照組增加46%。但bFGF在促創傷修復作用同時是否會引起瘢痕增生已受到學者的廣泛關注。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的過度沉積且降解減少是增生性瘢痕形成的主要原因［13］。有研究證實在瘢痕組織內膠原蛋白的合成是正常細胞的3倍。Sato等［14］研究表明，瘢痕疙瘩組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量顯著增加，何威等［15］研究發現疤痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ型膠原mRNA升高，其膠原合成量也明顯高于正常皮膚真皮成纖維細胞。本實驗提示bFGF在促進hUCMSCs增殖的情況下減少了hUCMSCs膠原的合成，對hUCMSCsⅠ型、Ⅲ型膠原mRNA的表達起減少的作用，Western blotting檢測結果與RT-PCR結果一致，提示其在促進創面愈合的同時并不會引起Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白沉積而導致瘢痕增生。其機制有待進一步研究。實驗結果提示我們可考慮將hUCMSCs與bFGF聯合應用于盆底功能障礙性疾病，有效地解決植入聚丙烯網片后所致網片侵蝕、暴露、陰道壁組織瘢痕增生攣縮的問題。本次研究主要探討在體外環境中bFGF的干預下hUCMSCs增殖及I、III膠原產生的影響，但hUCMSCs與bFGF合用移植于體內受損肌肉組織的微環境中是否直接分化成肌纖維母細胞，并修復盆底受損組織需要我們進一步研究。

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