異丹葉大黃素下調膀胱癌細胞的細胞周期蛋白D1表達并誘導G0/G1細胞周期阻滯*

方 勇， 侯 琦， 盧 瑜

(1浙江大學醫學院，附屬邵逸夫醫院腫瘤內科，浙江杭州310016;2中國醫學科學院，協和醫科大學藥物研究所，北京100050;3南京軍區杭州療養院療養二科，浙江 杭州310007)

膀胱癌是泌尿系統最常見的腫瘤［1］，無論是發病率還是死亡率均占首位，近年來發病率呈增長趨勢［2］。而浸潤性膀胱癌常出現威脅生命的遠處器官轉移，患者幾乎100%死亡。因此如果能尋找到一種天然化合物，可抑制膀胱癌細胞的侵襲和轉移，進而降低死亡率，這將具有極其重要的臨床意義［3］。

近年來的研究已經證實了膀胱癌的發展、預后均與細胞周期蛋白D1(cyclin D1)有關［4］。多項臨床研究表明，膀胱腫瘤早期即存在著異常細胞周期蛋白D1的表達［4-5］。細胞周期蛋白D1的過度表達與預后不良相關，可顯著降低患者術后的遠期生存率［6］。細胞周期蛋白D1是一個重要的細胞周期調控蛋白，通過結合細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)、磷酸化以及失活視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，在G1到S過渡的細胞周期進程中發揮著重要作用［7］。因此，下調細胞周期蛋白D1的表達和功能成為抗腫瘤研究領域中靶向藥物研究的重要熱點之一。

從多種中藥成份中提取出的寡聚二苯乙烯類化合物(oligostilbenes)具有多種生物學活性，尤其是抗腫瘤的活性正引起眾多研究者的關注［8-9］。我們研究從植物買麻藤中提取分離的中藥單體成分異丹葉大黃素(isorhapontigenin，ISO)對膀胱癌細胞的增殖、細胞周期蛋白D1表達水平、G0/G1細胞周期阻滯及遷移的影響。

材料和方法

1 材料

ISO由中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所提供，被溶解在DMSO，濃度為10 mmol/L，并進一步用DMSO稀釋，最后DMSO終濃度為0.1%(V/V)進行細胞培養實驗。相同濃度的DMSO(0.1%，V/V)被用來作為陰性對照。

抗CDK4、CDK6、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E、P21、P53以及GAPDH抗體均購自Santa Cruz。抗P27抗體購自Abcam。新生牛血清和DMEM購自Gibco。DMSO購自Sigma，ATP生物熒光檢測試劑盒購自Promega。人源性膀胱癌UMUC3細胞由美國紐約大學醫學院HUANG Chuanshu教授實驗室惠贈。由于UMUC3膀胱癌細胞株遺傳背景和較強的轉移傾向，并且高表達細胞周期蛋白D1，所以選定該細胞株進行后續的實驗。

2 方法

2.1 ATP生物熒光檢測法檢測細胞活性 將UMUC3細胞在含有10%新生牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，每3 d傳代1次。以5×103cells/well的密度接種于96孔培養板，以不同濃度ISO(0、5、10、20、40 和 60 μmol/L)作用于細胞共 48 h。提取ATP，熒光掃描儀測定熒光強度，軟件分析藥物各濃度抑制率，計算IC50，繪制抑制曲線，評估藥物作用。

2.2 UMUC3細胞周期蛋白D1表達的檢測 采用Western blotging法檢測UMUC3細胞株細胞周期蛋白D1蛋白表達情況。進行蛋白質的提取、定量和分離。轉膜后先后與10 g/L脫脂奶粉、鼠抗人抗體(細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴性激酶4、細胞周期蛋白依賴性激酶6、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E、P21、P27、P53和GAPDH)I抗4℃孵育過夜，過氧化物酶偶聯的II抗孵育，運用ECL Western blotting kit顯色并掃描實驗結果。

2.3 UMUC3細胞周期蛋白D1 mRNA表達的檢測收集UMUC3細胞約1×106，按TRIzolTM試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄反應體系:模板RNA 2 μg，10 mmol/L dNTP 1 μL，RNA 酶抑制劑(RNasin)335 nKat，Oligo dT181 μL，AMV 逆轉錄酶1 μL，5 × 逆轉錄酶緩沖液5 μL，終體積為25 μL，42℃水浴30 min，采用PubMed的Primer BLAST軟件設計細胞周期蛋白D1基因PCR引物(擴增產物大小408 bp)，序列如下:上游引物 5’-GAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTG-3’，下 游 引 物 5’-GAGGGCGGATTGGAAATGAACTTC-3’。同時以 GAPDH作為內參照(擴增產物大小285 bp)，上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，MGIAS-1000凝膠成像系統掃描定量并拍照。

2.4 PI染色法和流式細胞術檢測 胰酶消化并收集細胞，70%乙醇固定，4℃保存。600×g離心5 min，并用 PBS 液(含有0.5%BSA 和0.1%Triton X-100)洗2次。加入PI染色液避光保存30 min后，用流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測細胞周期DNA含量和凋亡細胞百分數。

2.5 細胞劃痕實驗 在6孔板中，以含10%FBS的DMEM培養UMUC3細胞直到生長到80%，以絲裂霉素處理1 h，抑制細胞的分裂。以無菌的移液器吸頭劃痕，用無血清的PBS洗滌3次后，去除劃下的細胞，加入含1%FBS血清在37℃、5%CO2條件下培養，根據指定的時間進行拍照，直到細胞長滿劃痕區域。以細胞遷移分析軟件(Cell Migration Analysis Software，Muscale LLC)定量分析細胞的遷移能力。

3 統計學處理

計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示。對各組之間采用t檢驗或方差分析，用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ISO抑制膀胱癌細胞的增殖

ISO 的化學結構是 4'-甲氧基-3，3'，5-三羥基二苯乙烯(4-methoxyresveratrol)，見圖 1A，分子量為258 D。我們首先通過實驗證實ISO對UMUC3細胞增殖的影響。UMUC3與不同劑量ISO(0～60 μmol/L范圍)共同培養48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，如圖1B所示，20 μmol/L以上濃度顯著抑制腫瘤細胞增殖。通過ATP生物熒光檢測法檢測細胞增殖活性，證實ISO抑制膀胱癌細胞呈明顯劑量依賴性，UMUC3細胞株的 IC50為(22.5 ±2.8)μmol/L(n=3)，見圖1C。進一步通過流式細胞術檢測，5 μmol/L ISO作用48 h后可誘導細胞出現G0/G1細胞周期阻滯，但不會誘導細胞凋亡;而20 μmol/L ISO可誘導UMUC3細胞出現典型的凋亡峰(Sub-G1峰)，見圖1D。

Figure 1.ISO inhibited proliferation of human bladder cancer UMUC3 cells.A:the structure of ISO.B:under phase-contrast microscope，representative images of UMUC3 cells pretreated with more than 20 μmol/L of ISO showed the inhibition of proliferation(×400).C:the UMUC3 cells were treated with different concentrations of ISO for 48 h，and followed by the detection of ATPase assay.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.D:flow cytometric analysis of cell cycle of UMUC3 cells treated with different concentrations of ISO for 48 h.20 μmol/L ISO could induce typical sub-G1(apoptosis)peak.圖1 ISO可顯著抑制膀胱癌UMUC3細胞的增殖

2 ISO可下調膀胱癌細胞細胞周期蛋白D1蛋白和mRNA表達

UMUC3與不同劑量(0～20 μmol/L)的 ISO培養24 h收集UMUC3細胞的蛋白質后，經Western blotting檢測均可見分子量為37 kD的細胞周期蛋白D1的表達受到顯著抑制(圖2A)。檢測其它細胞周期調控蛋白，ISO并未對CDK4、CDK6、細胞周期蛋白A 、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E、P53、P21和P27等產生影響。圖像分析系統表明(圖2B)，5、10 和 20 μmol/L ISO 呈劑量依賴性抑制細胞周期蛋白D1蛋白表達(P＜0.01)。同時，RT-PCR檢測結果顯示，ISO可顯著下調UMUC3細胞細胞周期蛋白D1 mRNA表達，見圖2C。

Figure 2.The protein and mRNA levels of cyclin D1 could be significantly down-regulated by ISO.A:the protein expression of cyclin D1，cyclin A，cyclin B1，cyclin E，CDK4，CDK6，P53，P27 and P21 detected by Western blotting.B:the ratio of cyclin D1/GAPDH in the UMUC3 cells pretreated with ISO.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.C:the mRNA expression of cyclin D1 detected by RT-PCR.圖2 ISO可下調UMUC3膀胱癌細胞周期蛋白D1蛋白和mRNA表達

3 ISO可誘導膀胱癌細胞出現G0/G1細胞周期阻滯

結合圖1D和圖2的結果，5 μmol/L ISO可顯著性下調細胞周期蛋白D1 mRNA水平，但不會誘導細胞凋亡。因此后面的實驗均采用5 μmol/L ISO進行研究。經流式細胞術檢測，5 μmol/L ISO作用于膀胱癌細胞12 h和24 h后，可出現不同程度G0/G1細胞周期阻滯。與對照組(47.33%)進行比較，在沒有顯著誘導腫瘤細胞凋亡的情況下，可分別在12 h(58.82%)和24 h(63.942%)顯著誘導細胞 G0/G1期生長停滯 (P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3.ISO induced G0/G1arrest of human bladder cancer UMUC3 cells.Exposure of UMUC3 cells to 5 μmol/L ISO led to significant induction of G0/G1growth arrest at both 12 h(47.33%vs 58.82%)and 24 h(47.33%vs 63.94%).AP:apoptosis.圖3 ISO可誘導膀胱癌細胞出現G0/G1細胞周期阻滯

4 ISO可顯著抑制膀胱癌細胞的遷移活性

經細胞劃痕實驗證明，與未加ISO預處理進行比較，5 μmol/L ISO均可在12 h和24 h顯著抑制膀胱癌細胞的遷移活性(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.ISO inhibited the migration of human bladder cancer UMUC3 cells detected by wound-healing assay.Cells were wounded and then treated with DMSO or ISO(5 μmol/L).At 0，12 and 24 h，phase-contrast pictures of the wounds at the same locations were taken and then migrated cells in the wound were counted.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 ISO可顯著抑制膀胱癌細胞遷移活性

討 論

泌尿系統來源的膀胱上皮腫瘤是我國最常見的泌尿系統惡性腫瘤。近年來發病率呈明顯上升趨勢，晚期患者接受進一步化放療的治療效果仍不理想［10］。本研究證實，ISO可抑制膀胱癌細胞的增殖，可下調細胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白水平，誘導膀胱癌細胞出現細胞G0/G1周期阻滯，并可抑制膀胱癌細胞遷移。

在我國，約25%的膀胱癌患者最終可發展為肌層浸潤性膀胱癌或轉移性膀胱癌。我們實驗室近期的研究證實，從植物買麻藤中提取分離的中藥單體成分ISO，劑量在20～60 μmol/L濃度條件下，能顯著下調包括人膀胱癌細胞在內的多種腫瘤細胞X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)水平，誘導細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用［3］。在本項研究中，我們證實低濃度 ISO(5 μmol/L)不僅能抑制膀胱癌UMUC3細胞株的細胞增殖，并可有效地下調細胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白質水平的表達，誘導細胞周期G0/G1期阻滯。

1991年發現細胞周期蛋白 D1，又稱 PRAD1、CCND1、BCL-1，其基因位于 11q13，長約 15 kb，含 5個外顯子，4個內含子，編碼的蛋白含295個氨基酸殘基，分子量37 kD［11］，為細胞內主要的癌基因之一。許多研究證據表明，在各種促進細胞炎性增殖的反應，包括致癌物質誘導細胞產生突變的過程中，首先可引起細胞周期的改變［12］。在腫瘤形成過程中，細胞周期蛋白D1比細胞周期蛋白D2和D3更加重要［13］。細胞周期蛋白D1對細胞周期蛋白依賴性激酶進行正調控，而周期素激酶抑制劑(cyclin kinase inhibitor，CKI)對細胞周期蛋白依賴性激酶進行負調控，一旦這種正負調控的平衡被破壞，細胞就可能異常增殖進而惡變。本研究證實ISO可下調細胞周期蛋白D1 mRNA的表達，但沒有影響CDK4和CDK6表達，也沒有對另一類包括P21、P27和P53等CKI蛋白產生顯著影響。

細胞周期蛋白D1作為癌基因最早見于甲狀旁腺癌，后被證實參與包括膀胱癌在內的多種實體瘤的分子病理機制。細胞周期蛋白D1表達并不限于某種病理類型，并且細胞周期蛋白D1在膀胱癌進展的各個階段持續存在。曾文利等［15］證實膀胱癌組織的細胞周期蛋白D1陽性率明顯高于正常膀胱黏膜和癌旁組織。細胞周期蛋白D1在癌變危險性大的良性病變、病理分級差以及浸潤性膀胱癌組織內，均高表達并與預后密切相關。細胞周期蛋白D1在膀胱癌中的異常表達可能參與膀胱癌的發生、發展過程［14］。除膀胱癌外，細胞周期蛋白D1在其它多種人類腫瘤，包括乳腺癌［16］、子宮頸癌［17-18］、結腸癌［19］、前列腺癌［20］、肝癌［21］和皮膚癌［22］等均不同程度地高表達。因此，細胞周期蛋白D1是腫瘤細胞周期調控及藥物治療中潛在的治療靶點。

例如，Li等［23］證實了在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)中，細胞周期蛋白D1表達缺陷后細胞遷移活性明顯減低。本實驗結果證實ISO(5 μmol/L)可顯著抑制細胞周期蛋白D1表達，并通過細胞劃痕實驗證實可下調膀胱癌細胞的遷移，與Li等的結果相一致。目前下調或抑制細胞周期蛋白D1表達的分子生物學方法包括:細胞周期蛋白D1亞型(全長細胞周期蛋白D1)與小分子細胞周期蛋白依賴性激酶4/6抑制劑PD0332991［24］、小分子干擾核糖核酸(RNA干擾)［25］、細胞周期蛋白D1基因敲除［26］和抑制糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β 活性［27］。但這些基因治療，目前仍具有穩定性差、需要多次重復給藥、細胞膜通透性差、轉染效率不穩定等不足。患者的安全性受到威脅，極大限制了臨床使用。

因此，本研究將為治療膀胱癌和其它腫瘤提供新的思路和治療策略，為進一步研究細胞周期蛋白D1在參與實體腫瘤細胞遷移、腫瘤細胞G0/G1周期調控中的作用提供了新思路，也為臨床采用中藥單體綜合治療腫瘤提供了新的策略，尤其是對一些細胞周期蛋白D1基因高表達的腫瘤。

本研究還有不足之處，如:ISO可在mRNA和蛋白水平下調細胞周期蛋白D1表達水平，其具體機制尚不清楚;另外，ISO對細胞內細胞周期調控蛋白如CDK均未產生影響，但對其它信號轉導途徑如JNK/c-Jun、JAK/Stat等是否影響，這些都有待于進一步研究。

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