人表皮生長因子受體顯性負性突變體誘導胃癌細胞發生G0/G1期阻滯*

廖 剛， 王子衛△， 張 能， 董浦江， 湯為學

(重慶醫科大學1附屬第一醫院胃腸外科，3附屬第一醫院實驗研究中心，4基礎醫學院病理生理學教研室，重慶400016;2云南省第一人民醫院普通外科，云南昆明650032)

人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為酪氨酸蛋白激酶型受體，由胞外區、跨膜區和胞內區三部分構成，與配體結合后，相互之間形成同源二聚體，也可與其它的酪氨酸激酶受體形成異源二聚體，導致胞內區的酪氨酸激酶區的激活，最終引起一系列相關基因活化，在腫瘤發生發展中扮演著重要角色［1-3］。缺失胞內區的EGFR為其顯性負性突變體(dominant negative EGFR，DNEGFR)，可以阻斷EGFR信號通路。腫瘤是一類細胞周期相關疾病，胃癌也不例外。針對腫瘤細胞周期進行調控，近年來一直是腫瘤生物治療的重要研究方向。DNEGFR是否對人胃癌細胞的周期有調控作用?以及具體分子機制是什么?目前未見相關報道。

材料和方法

1 細胞

人胃癌細胞株SGC-7901及NCI-N87購自中國科學院細胞庫。pEGFP-N1質粒穩定轉染的SGC-7901及NCI-N87細胞，穩定表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP);pEGFPN1-DNEGFR質粒穩定轉染的SGC-7901及NCIN87細胞，穩定表達DNEGFR;均由我們前期實驗篩選成功保存［4］。

2 主要試劑、耗材及儀器

PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.2 ～7.4)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。無水乙醇購自重慶川東化工(集團)有限公司。PI購自Sigma-Aldrich。RPMI-1640培養基粉末、胰酶和G418購自Invitrogen。Ser9位點磷酸化糖原合成激酶3β［phosphorylated glycogen synthase kinase 3 beta at Ser9，p-GSK-3β(Ser9)］兔單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology。GAPDH(FL-335)抗體、p21(C-19)抗體、cyclin D1(A-12)抗體、周期素依賴性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)(H-298)抗體和p27(C-19)抗體購自Santa Cruz。BCA protein assay kit、Pierce ECL Western blotting substrate 和 stripping buffer購自 Thermo Fisher Scientific。RIPA裂解液(強)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PMSF(100 mmol/L)、彩色預染蛋白質分子量標準和DS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)購自江蘇省碧云天生物技術研究所。PVDF膜購自Bio-Rad。

Forma 310系列直熱式 CO2培養箱為Thermo Fisher Scientific產品。SW-CJ系列醫用型潔凈工作臺為蘇州安泰空氣技術有限公司產品。Gel Doc XR凝膠成像系統、電泳儀和680型全自動酶標儀為Bio-Rad產品。流式細胞儀為BD Biosciences產品。

3 方法

3.1 實驗分組 實驗分為如下6組:(1)SGC-7901細胞空白對照組(即SGC-7901細胞未轉染組，US組);(2)SGC-7901細胞pEGFP-N1質粒轉染組(ES組);(3)SGC-7901細胞pEGFPN1-DNEGFR質粒轉染組(DS組);(4)NCI-N87細胞空白對照組(即NCI-N87細胞未轉染組，UN組);(5)NCI-N87細胞pEGFP-N1質粒轉染組(EN組);(6)NCI-N87細胞pEGFPN1-DNEGFR質粒轉染組(DN組)。

3.2 細胞培養 未轉染細胞常規培養于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養液，在37℃、5%CO2及相應濕度條件的CO2孵箱中培養，定期觀察細胞生長情況，在對數生長期用0.25%的胰酶消化，進行傳代培養。轉染的 SGC-7901細胞，采用 150 mg/L G418終濃度的完全培養基維持培養;轉染的NCIN87細胞，采用250 mg/L G418終濃度的完全培養基維持培養。

3.3 細胞周期檢測 細胞周期檢測根據文獻［5-6］操作并作一些改進。取無菌Eppendorf管，預裝1 mL 70%乙醇，放入4℃冰箱預冷。用胰酶分別消化收獲處于對數生長期的6組單層胃癌細胞，1 000 r/min離心5 min棄上清，用預冷PBS洗細胞3次。第3次洗細胞離心棄PBS時，不要完全吸棄PBS，待附在離心管壁的PBS回流到管底后，用微量移液器輕輕吹打使離心到管底的細胞成細胞懸液。將細胞懸液加入預冷的70%乙醇，4℃固定過夜。1 000 r/min離心5 min棄70% 乙醇，PBS洗細胞3次。加入0.5 mL PI染液重懸細胞，并放在37℃水浴中孵育30 min。設定流式細胞儀參數，進行細胞周期檢測。細胞周期分布采用Modifit-3軟件(Verity Software House)計算每組細胞重復實驗3次。

3.4 Western blotting檢測 Western blotting實驗方法主要根據文獻［7］并作以下改進，cyclin D1和p27抗體稀釋比例為1∶100，CDK2、p21和 GAPDH抗體稀釋比例為1∶200，p-GSK-3β(Ser9)抗體稀釋比例為1∶1 200，使用Gel Doc XR凝膠成像系統采集圖像。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參照蛋白條帶灰度值，實驗重復3次。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，如果差異有統計學意義則進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，應用SPSS 17.0 for Windows軟件處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 細胞生長情況

各組人胃癌細胞生長狀態均良好，但是生長速度有一定差異。相對于US組及ES組，DS組細胞生長速度明顯要慢些。同樣，相對于UN組及EN組，DN組細胞生長速度明顯要慢些。

2 DNEGFR導致G0/G1期阻滯

對于SGC-7901細胞，US組及ES組G0/G1期分別為(50.03±2.01)%和(49.61±0.49)%，二者沒有顯著差異，DS組則上升到(70.88±0.85)%(P＜0.05);US組及ES組S期分別為(43.63±1.26)%和(43.63±0.64)%，二者沒有顯著差異，DS組則降低到(21.58±1.40)%(P＜0.05)。對于NCI-N87細胞，UN組及 EN組 G0/G1期分別為(47.90±2.52)%和(48.79±4.12)%，二者沒有顯著差異，DN組則上升到(69.27±4.52)%(P＜0.05);UN組及EN組S期分別為(41.77±3.08)%和(42.76±3.38)%，二者沒有顯著差異，DN組則降低到(21.88±2.40)%(P＜0.05)。另外，在DS及DN組中，流式細胞周期測定圖中G0/G1期峰前出現了亞二倍體峰，表明DNEGFR-EGFP還能夠誘導胃癌細胞凋亡，見圖1。

Figure 1.Cell cycle assay of gastric cancer cells.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs US or ES;#P ＜0.05 vs UN or EN.圖1 胃癌細胞周期分析

3 DNEGFR對細胞周期相關蛋白水平的調控作用

US組及ES組SGC-7901細胞活性CDK2、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)、p21 和 p27 蛋白水平沒有顯著差異;與US組及ES組比較，DS組CDK2、cyclin D1和 p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低(P ＜0.05)，p21、p27蛋白水平則升高(P＜0.05)。UN組及 EN組NCI-N87 細 胞 活 性 CDK2、cyclin D1、p-GSK-3β(Ser9)、p21和p27蛋白水平沒有顯著差異;與UN組及EN組比較，DN組CDK2、cyclin D1和pGSK-3β(Ser9)蛋白水平降低(P ＜0.05)，p21、p27 蛋白水平則升高(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Expression of the proteins relative to cell cycle detected by Western blotting.Mean ±SD.n=3.*P ＜0.05 vs US or ES;#P＜0.05 vs UN or EN.圖2 Western blotting檢測細胞周期相關蛋白的表達

討 論

細胞周期(cell cycle)是指一個連續分裂的細胞從一次分裂完成開始，直到下一次分裂完成為止經歷的全過程［8］。細胞周期包括4個時相:G1期、S期、G2期和M期。G1期為DNA合成前期，主要合成RNA和蛋白質，其是DNA復制所必需的，影響著S期的正常啟動;S期為DNA合成期;G2期為DNA合成后期，主要進行有絲分裂中新細胞形成所必需物質的合成，是決定細胞能否順利進入M期(有絲分裂期)的關鍵。在哺乳動物細胞G1期存在特定的時點，Pardee［9］命名此點為限制點(restriction point)，在限制點之前如果細胞缺乏外界生長信號的持續刺激，則其會終止分裂周期進入休眠狀態，稱為G0期。在G0期，細胞可長期存活而不分裂增殖，當受到生長信號刺激，即可從G0期返回G1期繼續生長分裂進程，而且即使在G1中晚期通過限制點后再除去外界生長信號的刺激，也不會阻止細胞進入S期。

細胞通過G1中晚期限制點后，細胞周期開始運行，一套嚴格的質量監控機制開始運作，它就是細胞周期的檢查點(check point)機制。檢查點由Weinert等［10］和 Hartwell等［11］首先發現并描述，實質上是細胞在長期進化過程中發展出的一系列存活機制，作為在基因組或紡錘體損傷，或細胞周期某一事件不能按時完成情況下的一種補救措施，在G1/S交界點存在DNA損傷檢查點［12］。Cyclin D1是一重要的細胞周期調控分子［13］，不僅是調控細胞通過G1期限制點(即G0/G1期轉換)的關鍵分子之一，而且是G1/S轉換的關鍵分子，cyclin D1-CDK4/6可使pRb處于磷酸化狀態而滅活［14］，釋放出其扣留的大量轉錄因子，尤其是E2F，啟動細胞周期進入S期所需蛋白的轉錄。另外，cyclin E-CDK2也能夠使pRb處于磷酸化狀態而滅活［15-17］。Cyclin D1-CDK4/6在 G1期早期即開始發揮作用導致pRb磷酸化 ，而cyclin E-CDK2直到G1晚期才開始發揮作用，cyclin D1-CDK4/6發揮作用導致pRb部分磷酸化是cyclin ECDK2發揮作用的基礎［16-17］。p21和p27是重要的CDK 抑制蛋白，p21 能夠抑制 CDK2 和 CDK4［18］，p27則能夠抑制 CDK4、CDK6 或者 CDK2［19］。

在本實驗中，人胃癌細胞被pEGFPN1-DNEGFR轉染后，將表達DNEGFR-EGFP融合蛋白，EGFP作用在于其便于對DNEGFR進行定位，對DNEGFR功能無影響;DNEGFR降低內源性EGFR Ser1046位點磷酸化水平，進而降低內源性EGFR功能，具有顯性負調控作用［20］。我們采用pEGFPN1-DNEGFR轉染人胃癌細胞，通過表達DNEGFR來阻斷人胃癌細胞EGFR信號轉導通路，探討其對人胃癌細胞周期的影響及分子機制。

我們采用流式細胞術進行細胞周期檢測，結果提示DS及DN組胃癌細胞G0/G1期比例均升高，而S期比例均下降，表明DNEGFR能夠導致胃癌細胞G0/G1期阻滯，與采用EGFR單克隆抗體西妥昔單抗(cetuximab)在鱗狀細胞癌細胞中的研究結果基本一致［21］。那么，DNEGFR能夠導致胃癌細胞G0/G1期阻滯是否與CDK2、cyclin D1、p21和p27相關呢?如果有關，具體調控機制又是什么呢?

為了明確胃癌細胞G0/G1期阻滯的分子機制，我們采用Western blotting檢測 CDK2、cyclin D1、p21、p27和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。檢測結果提示DS及DN組胃癌細胞CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平降低，而p21和p27蛋白水平則升高。對于GSK-3β，Ser9位點磷酸化后處于其非活性狀態［22］。據此，我們推論，pEGFPN1-DNEGFR 轉染胃癌細胞后，表達出DNEGFR蛋白，DNEGFR與內源性EGFR競爭結合EGF，導致EGF缺乏(EGF withdrawal)，通過降低Ser9位點磷酸化水平激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低，cyclin D1-CDK4/6含量減少;DNEGFR還使CDK2蛋白水平降低，cyclin E-CDK2含量減少;同時，DNEGFR上調p21、p27蛋白水平，抑制cyclin D1-CDK4/6及cyclin E-CDK2活性;以上三方面因素共同參與使pRb處于低磷酸化狀態，導致大量轉錄因子尤其是E2F被扣留，最終使胃癌細胞發生G0/G1期阻滯。

綜上所述，我們發現DNEGFR能夠誘導胃癌細胞發生G0/G1期阻滯，并明確了部分分子機制，將為胃癌生物治療研究提供新思路。然而，細胞周期的調控環節極為復雜，參與其中的蛋白非常多。是否有其它因素參與胃癌細胞的G0/G1期阻滯呢?這有待我們的進一步研究來明確。

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