2型登革病毒通過線粒體途徑誘導EA.hy926細胞凋亡*

齊一鳴， 黃俊琪

(中山大學中山醫學院免疫學研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室，廣東廣州510080)

登革熱是是世界上最常見的蚊媒傳播疾病之一，但目前仍缺乏合適的實驗動物模型和特異性的治療手段，也沒有安全的疫苗可以預防其傳播。對于重癥型的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)或登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)，血管內皮損傷導致的血漿滲漏及出血是其主要的臨床特征。國內外均有研究表明，2型登革病毒(dengue virus type 2，DEM-2)可以直接或間接誘導宿主的血管內皮細胞凋亡［1-3］，然而，通過何種途徑誘導凋亡卻觀點各異。本研究主要通過對登革病毒感染前后EA.hy926細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)變化情況及 caspase-9 活性的觀察，討論線粒體凋亡途徑是否也參與了DHF或DSS的發病機制。

材料和方法

1 材料

1.1 病毒與細胞系 DENV-2 NGC病毒株來自中山大學中山醫學院微生物學教研室，由本室進行擴增定量和保存。EA.hy926細胞由人血管內皮細胞及A549肺癌上皮細胞融合而成，由中山大學中山醫學院干細胞中心贈予。

1.2 主要試劑及檢測儀器 培養基DMEM/F12、胎牛血清和青鏈霉素雙抗為Gibco。噻唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］為Sigma產品。檢測JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒為Genmed產品，流式細胞儀FACSCalibur為BD產品，熒光顯微鏡Axio Observer Z1為Carl Zeiss產品，酶標儀為BioTek產品。

2 方法

2.1 細胞培養 EA.hy926細胞用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養及傳代。

2.2 登革病毒感染 取2型登革病毒液定量至(109pfu/L)，加入EA.hy926細胞培養瓶中，感染復數(multiplicity of infection，MOI)為4，吸附1 h。棄上清，加入完全培養基，于37℃、5%CO2條件下維持培養，分別于24 h、36 h和48 h后棄去培養液，收集細胞。

2.3 MTT法 收集處于對數生長期的EA.hy926細胞調整細胞至5 000 cells/well，鋪于96孔板中，于37℃、5%CO2溫箱中培養。細胞貼壁后，對照組加含10%胎牛血清的DMEM培養液，感染組加含10%胎牛血清的DMEM培養液及DENV病毒液5 μL，每個組設6個平行孔。分別培養24 h、36 h和48 h后，每孔加入1 g/L MTT溶液50 μL，37℃孵育4 h。棄上清，加入100 μL DMSO使結晶溶解。室溫下輕度振蕩15 min，1 h內用酶標儀測出570 nm處的A值。以下公式計算出DENV-2對EA.hy926細胞生長的抑制率:細胞生長抑制率(%)=(未感染細胞A值－感染細胞A值)/未感染細胞A值×100%。

2.4 線粒體膜電位的檢測 取對數期生長的EA.hy926細胞，0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min 離心5 min，PBS洗滌2遍。流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測均按照試劑盒說明書進行。

2.5 Caspase-9活性檢測 采用caspase-9活性蛋白酶檢測試劑盒(Invitrogen)測定。裂解EA.hy926細胞提取總蛋白，定量并稀釋至終濃度2 mg/L。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。于波長405 nm處讀取A值。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析，計數資料用(mean±SD)表示，組間數據的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DENV-2感染EA.hy926細胞后對細胞活性的抑制

MTT檢測發現，EA.hy926在感染DENV-2 24 h、36 h及48 h后細胞活性受到顯著抑制，550 nm處的A 值分別為1.204 ±0.042、1.216 ±0.057 和1.293 ±0.087，各個時點均低于未感染組(0.730 ± 0.141、0.433±0.034 和 0.360 ±0.113)，差異有統計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)。隨時間的延長，感染組細胞活性持續降低而未感染組幾乎無差異，見圖1。

Figure 1.EA.hy926 cell growth inhibtion after DENV-2 infection for 24 h，36 h or 48 h detected by MTT assay.Mean±SD.n=6.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs uninfected.圖1 DENV-2感染 EA.hy926細胞24 h、36 h、48 h后細胞活性變化

2 流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化

JC-1可以以單體或聚合體的形式積聚于線粒體中。在線粒體發生去極化時，JC-1以單體形式占主導，發射綠色熒光(～530 nm);當電位復極至－140 mV甚至更高時，則主要以聚合物形式存在并發射紅色熒光(～590 nm)。借助JC-1復合體不同形式所發射的紅色/綠色熒光比值(FL2/FL1)，可以表示線粒體膜電位的改變。DENV-2感染24 h、36 h及48 h后，感染組 Δψm均值分別為3.15±0.28、2.23±0.36和2.40±0.49;未感染組為4.80±0.33、3.48±0.43和3.23±0.20。感染組各時點均較未感染組低，差異有統計學意義(均P＜0.01)，且感染組Δψm的最低點出現在感染后36 h，見圖2、3。

Figure 2.Mitochondrial membrane potential changes in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h detected by flow cytometry.圖2 流式細胞術檢測DENV-2感染24 h、36 h和48 h后EA.hy926細胞線粒體膜電位的變化

Figure 3.Mitochondrialmembrane potential changes in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs uninfected.圖3 DENV-2感染24 h、36 h和48 h后 EA.hy926細胞線粒體膜電位的變化

3 熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的變化

未感染組隨著時間的增加，雖然胞漿內散在的紅色顆粒逐漸減少，但是綠色熒光基本無變化;感染組綠色熒光增強，紅色熒光則在36 h表達最弱。與流式細胞術檢測結果一致，見圖4。

Figure 4.Mitochondrialmembrane potential changes in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h detected by fluorescence microscopy.Scale bar=20 μm.圖4 熒光顯微鏡觀察 DENV-2感染24 h、36 h、48 h后EA.hy926細胞線粒體膜電位的變化

4 感染后caspase-9活性的變化

DENV-2感染后，24 h即可出現caspase-9活性上升，且其活性隨著時間的延長而逐漸增加。感染組24 h、36 h及48 h caspase-9活性的 A值分別為0.134 ±0.010、0.137 ±0.010 和 0.140 ±0.020，未感染組分別為0.038 ±0.010、0.038 ±0.010 和 0.040±0.010，2組之間的差異均有統計學意義(P＜0.01)，見圖5。

Figure 5.Caspase-9 activity in EA.hy926 cells infected with or without DENV-2 for 24 h，36 h and 48 h.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs uninfected.圖5 DENV-2感染 EA.hy926細胞24 h、36 h和48 h后caspase-9活性的變化

討 論

細胞凋亡或程序化死亡是機體抵抗微生物入侵、去除被感染細胞、限制病原擴散的重要病理生理過程［4］。我們前期的研究已經證實，DENV-2感染可以通過活化Fas/FasL及caspase級聯反應誘導原代的 HUVECs發生凋亡，以 48 h 最明顯［5-6］。而EA.hy926細胞來源于 HUVECs，同樣具有內皮細胞的特性，我們在誘導EA.hy926細胞發生凋亡時則在感染36h后凋亡率增加最為顯著［7］。本組實驗結果顯示，細胞生長的抑制率隨著感染時間的延長而增加，48 h達峰值。外源性MTT通過檢測活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的數量來間接反映活細胞的數量［8］，而感染組細胞較未感組活細胞數量減少，即線粒體總琥珀酸脫氫酶的含量減少，這就提示了線粒體也可能參與了DENV-2誘導EA.hy926細胞發生凋亡的途徑。線粒體是程序化死亡信號轉導途徑中起關鍵調節作用的細胞器。線粒體膜電位的破壞被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件之一［9］。為了進一步探究線粒體是否參與了DENV-2感染后EA.hy926細胞發生凋亡的通路，我們通過JC-1染色檢測了Δψm的變化。流式細胞術和熒光顯微鏡的結果都顯示，DENV-2作用EA.hy926細胞后，Δψm降低并在36 h最為明顯，晚于MTT活性抑制高峰的48 h。但考慮到MMP變化是凋亡早期事件，應早于或同時于凋亡的發生，故兩高峰產生了時間差異。線粒體膜電位降低后，引起膜通道非特異開放，細胞色素酶C從內膜脫落出來并釋放到胞質中，進而與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic proteinase-activating factor 1，Apaf1)結合形成復合物，激活pro-caspase-9，隨之活化caspase-9。而caspase-9的激活是啟動caspase級聯放大反應、誘發細胞凋亡的第一步［10］。本結果顯示，DENV-2感染后早期即可出現caspase-9活性的顯著增高，并且維持在相對高水平。

以往文獻多報道使用線粒體標記物羅丹明123(rhodamine 123，Rh123)來檢測 Δψm，但是 Rh123 容易發生自身淬滅，而且產生較強的非線性反應，不易定量，僅可作為一種定性的檢測手段。更重要的是，Rh123具有濃度依賴性，在濃度大于1 μmol/L時即可影響線粒體的呼吸作用及ATP酶的活性，當濃度達10 μmol/L時可引起更嚴重的線粒體腫脹，不僅在早期影響Δψm的改變，還使得后期的凋亡結果出現更多的假陽性［11］。而本研究采用的JC-1對染色細胞內的膜電位變化較Rh123雖敏感性稍低，但也因此它可以更為真實一致的反應線粒體的去極化，假陽性少。聚合體散發的紅色熒光，可以線性反映Δψm的改變，而使用參比的方法使JC-1檢測的靈敏度更高。另外，實驗也證明，JC-1在濃度為 550 nmol/L時對線粒體的呼吸作用基本沒有影響，當增大濃度至10 μmol/L時，細胞存活率仍可維持在95%以上［12］。本研究中，標記 EA.hy926細胞線粒體的JC-1濃度為1 μmol/L，因此，對于細胞活性和形態幾乎沒有不良作用。另外，在進行EA.hy926細胞感染時，我們采用了含2%血清的培養基替換了正常培養條件下含10%血清的培養基，以減少對病毒擴增、感染能力的抑制。研究發現，血清濃度可顯著影響病毒的增殖能力，牛血清濃度在2%時，病毒可達到最快的增殖速度和最高的滴度;同時，該濃度也可以較持久地維持細胞的生命狀態，保證感染過程的順利進行［13］。

［1］ Kanlaya R，Pattanakitsakul SN，Sinchaikul S，et al.The ubiquitin-proteasome pathway is important for dengue virus infection in primary human endothelial cells［J］.J Proteome Res，2010，9(10):4960-4971.

［2］ Wang Z，Shi Q，Li S，et al.Hyperthermia induces platelet apoptosis and glycoprotein Ibα ectodomain shedding［J］.Platelets，2010，21(3):229-237.

［3］ Vásquez Ochoa M，García Cordero J，Gutiérrez Casta～neda B，et al.A clinical isolate of dengue virus and its proteins induce apoptosis in HMEC-1 cells:a possible implication in pathogenesis［J］.Arch Virol，2009，154(6):919-928.

［4］ 曾 葭，陳小宇，祝愛珍，等.鹽霉素增強吉非替尼誘導人肺腺癌細胞株A549凋亡的作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(12):2147-2153.

［5］ Liao H，Xu J，Huang J.FasL/Fas pathway is involved in dengue virus induced apoptosis of the vascular endothelial cells［J］.J Med Virol，2010，82(8):1392-1399.

［6］ Long X，Li Y，Qi Y，et al.XAF1 contributes to dengue virus-induced apoptosis in vascular endothelial cells［J］.FASEB J，2012，Dec 4.［Epub ahead of print］.

［7］ 龍喜貴，李 穎，鄭毅濤，等.CXCR4抑制劑AMD3100對2型登革熱病毒誘導血管內皮細胞株Eahy926凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(4):632-637.

［8］ Spector DL，Goldman RD，Leinwand LA.細胞實驗指南［M］.北京:科學出版社，2006:118-125.

［9］ Mu～noz-Pinedo C.Signaling pathways that regulate life and cell death:evolution of apoptosis in the context of self-defense［J］.Adv Exp Med Biol，2012，738:124-143.

［10］ 劉江濤，郭 雄，吳翠艷，等.線粒體細胞色素C介導的caspase-9激活通路參與大骨節病關節軟骨細胞凋亡的發生機制［J］.西安交通大學學報:醫學版，2011，32(5):580-584.

［11］ Emaus RK，Grunwald R，Lemasters JJ.Rhodamine 123 as a probe of transmembrane potential in isolated rat-liver mitochondria:spectral and metabolic properties［J］.Biochim Biophys Acta，1986，850(3):436-448.

［12］ Keil VC，Funke F，Zeug A，et al.Ratiometric high-resolution imaging of JC-1 fluorescence reveals the subcellular heterogeneity of astrocytic mitochondria［J］.Pflugers Arch，2011，462(5):693-708.

［13］ 孫朝暉，石玉玲，冼 江，等.HSV-2 333株在Vero細胞中持續感染及增殖特性研究［J］.醫學臨床研究，2009，26(5):753-756.