非小細胞肺癌中ROS1基因重排及其臨床意義

徐陸亭 趙瑞景 董增軍 朱鐵年

在過去的十年里，針對腫瘤重要分子標志及信號傳導途徑治療癌癥的靶向藥物研究取得了重大進展。根據分子標志篩選特定的疾病人群，應用阻斷此標志的小分子化合物或單克隆抗體為腫瘤靶向治療提供了個體化治療模式的新思路，即發現新靶標，開發靶向治療新藥物，篩選靶向藥物治療患者。作為肺癌驅動基因之一的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶突變體的發現開啟了非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）靶向治療之門[1]。對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）的臨床研究歷程，從非選擇患者到選擇特定患者治療群，從臨床病理選擇到分子標志物檢測EGFR基因突變，而以EGFR-TKIs一線治療EGFR基因突變患者的成功，標志性的奠定和推動了肺癌個體化治療的進程[2,3]。近兩年針對間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）融合基因的NSCLC靶向治療的再次成功為肺癌驅動基因的研究錦上添花[4-6]，而越來越多的肺癌相關驅動基因的發現（如ROS1、RET、KRAS、HER2、BRAF、PI3KCA、MEK1/2、MET等），終將為NSCLC個體化治療鋪就藍圖[7]。本文對新發現ROS1融合基因靶點及針對這些靶點的檢測方法以及藥物治療進展做一綜述。

1 ROS1結構和生物學特性

受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）是多種生長因子、細胞因子和激素的高親和力細胞表面受體和胞內受體偶聯的酪氨酸蛋白激酶總和。EGFR屬于I類RTK的EGFR/ErbB家族，而ALK屬于X類RTK的LTK 家族，ROS 1則屬于II類RTK的胰島素受體家族。作為一個獨特的受體酪氨酸激酶，ROS1在進化上相對保守。1982年，ROS1在UR2鳥肉瘤病毒中被確定為具有獨特致癌作用的病毒原癌基因，此v-ROS1與gag基因發生融合而高表達具有致癌作用的蛋白質酪氨酸激酶融合蛋白p68gag-ROS[8,9]。哺乳動物原癌基因c-ROS1位于第6號染色體q21區，全長cDNA包含44個外顯子，編碼2347個氨基酸，分子量為259 kDa。基本結構由胞外N-末端配體結合區（氨基酸1-1861）、跨膜區（氨基酸1862-1882）及胞內C-末端464個氨基酸構成的酪氨酸激酶活性區（氨基酸1883-2347）組成[10]。盡管ROS1為少數孤兒受體RTK，而缺乏對其配體的認知，但在蛋白質序列與結構分析上屬于II類RTK胰島素受體家族。最近的氨基酸序列分析顯示，在酪氨酸激酶區ROS1與ALK有49%的同源性，因為ALK酪氨酸激酶小分子抑制劑克唑替尼（crizotinib）的作用靶點在ALK激酶催化區的ATP結合位點，ROS1激酶催化區的ATP結合位點與ALK激酶催化區的ATP結合位點二者同源性高達77%[11]，因此ALK酪氨酸激酶小分子抑制劑克唑替尼（crizotinib）在治療ROS1發生融合變異的NSCLC中具有明顯療效[12-15]。

盡管ROS1受體酪氨酸激酶在人體正常組織的功能尚未明了，但ROS1異位表達以及ROS1激酶的變異活化見于諸多腫瘤，如多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌以及肝外膽管癌，顯示ROS1激酶活化誘導細胞的異常增殖與存活。在致病機理方面，盡管缺乏ROS1激活的合適配體或小分子激活劑，先前應用點突變和EGFR胞外受體部分構建的EGFR-ROS1嵌合蛋白表達技術業已證明，ROS1受體酪氨酸激酶參與激活多條下游信號轉導通路，包括RASMAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3以及PLCγ/IP3和SHP2/VAV3途徑。前三者與腫瘤細胞增殖與存活有關，而后兩者介導細胞形態轉化和參與腫瘤細胞轉移和遷移[11,16,17]。最近Gu等[18]在鼠白血病細胞系Ba/F3中高表達不同亞型的FIG-ROS1[fusion in glioblastoma (FIG)-ROS1]融合基因再次證明上述5種信號轉導通路參與ROS1融合蛋白的致瘤作用。此外，ROS1激酶結合細胞骨架蛋白和細胞-細胞相互作用蛋白，直接或間接介導細胞骨架蛋白磷酸化，參與正常細胞的轉化過程[19]。盡管類似其它RTK二聚化進而誘導其激酶活性異常活化的模式在報道中只是推測，但是多項試驗[20,21]證明活化誘導ROS1-RTK胞內激酶催化區酪氨酸自身磷酸化（Y2274和Y2334）在正常細胞轉化至瘤作用中尤為重要。

2 ROS1融合基因

迄今為止，在非小細胞肺癌中已發現至少有9種不同的ROS1融合基因（圖1），包括最早發現于神經膠質母細胞瘤中的FIG-ROS1以及CD74-ROS1、SLC34A2-ROS1、TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、EZR-ROS1、LRIG3-ROS1、KDELR2-ROS1和CCDC6-ROS1[21-27]。1987年在多形性神經膠質母細胞瘤細胞株U118MG中首先發現了FIG-ROS1融合基因[28]。FIG-ROS1融合基因的形成源于膠質母細胞瘤第6號染色體內FIG和ROS1基因間一段240 kb DNA片段缺失（6q21）導致FIG-ROS1基因融合并持續表達活化的ROS1 RTK激酶[22]。最近，美國Cell Signaling Technology公司的科學家應用自制的高敏感高特異兔單克隆抗體建立的免疫組織化學染色技術結合已知融合伙伴序列的RT-PCR技術在NSCLC中國人群中篩查ROS1融合基因時，除了檢測到SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1兩種常見的融合基因外，還首次在NSCLC中發現了FIG-ROS1融合基因[25]。

早在2007年科學家們在應用酪氨酸激酶蛋白組學技術篩選腫瘤致癌基因時就發現了在NSCLC中存在ROS1基因重排現象[5,23]。文中作者對41例NSCLC細胞株和150例中NSCLC患者的腫瘤樣本進行了大規模的酪氨酸激酶篩選。結果除了發現ALK基因重排外，還發現1例NSCLC細胞株（HCC78）和1例患者的腫瘤樣本中有ROS1基因重排；通過RT-PCR和DNA測序確定了兩個獨立的ROS1融合產物，即SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1融合基因。在HCC78細胞系中，鈉磷酸鹽轉運蛋白家族成員A2（SLC34A2）N-末端部分序列與ROS1部分跨膜區及全部胞內C-末端形成兩種不同長度的SLC34A2-ROS1融合蛋白。盡管SLC34A2蛋白在人體組織中廣泛表達，但SLC34A2在小鼠II型肺泡上皮的表達參與了肺泡表面活性劑的合成，而SLC34A2基因突變與肺泡微小結石癥形成有關，從而推斷SLC34A2-ROS1基因重排可能參與了NSCLC的發病機制[29]。此HCC78細胞系后來被廣泛應用于ROS1融合基因的研究。在1例NSCLC患者樣本中，CD74的外顯子1-6與ROS1部分胞膜和/或胞內C-末端氨基酸序列（包括外顯子32/34到44）也形成兩種不同長度的CD74-ROS1融合蛋白（圖1）。CD74-ROS1基因重排在ROS1基因重排中最為常見，約占30%。CD74具有巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibition factor,MIF）受體功能，MIF-CD74相互作用參與非受體酪氨酸激酶介導的MAPK和Rho GTP酶活化，因而對巨噬細胞在宿主防御功能有調節作用[30,31]。CD74同時作為一個MHC II類分子相關蛋白，部分參與了MHC II類蛋白的形成和運輸。隨后的體外和小動物體內轉化實驗證明SCL34A2-ROS1和CD74-ROS1具有致癌作用[18,32]，而且后者還通過E-Syt1介導癌細胞的浸潤和轉移[32]。此后近兩年如火如荼尋找肺癌驅動基因的研究[14,24,26,33]進一步發現了TPM3-ROS1、SDC4-ROS1、LRIG-ROS1、EZR-ROS1和KDELR2-ROS1融合基因，并且均被證明在實驗動物體內有致癌作用。

由于存在SCL34A2-ROS1基因重排的HCC78細胞系與上述其它ROS1融合基因在人或鼠真核細胞轉染體系相比對克唑替尼只有中度敏感[12-14]，因此認為ROS1融合伙伴對ROS1酪氨酸激酶活性的影響因其亞細胞定位的差異可能反映出ROS1基因重組陽性腫瘤的臨床病理表現和自然形成能力的潛在差異。比如，FIG-ROS1（S）和FIG-ROS1（L）之間的激酶活性和轉化作用的差異歸因于其在亞細胞的定位差異[18]。

與EML4-ALK基因重排產生的EML4-ALK融合蛋白定位于細胞質不同，不同的ROS1融合蛋白在細胞中的定位包括彌漫性胞漿分布、核周聚集、胞內微泡以及跨膜分布。SCL34A2-ROS1和CD74-ROS1為跨膜蛋白，而FIGROS1定位于細胞質或高爾基體。但是這些融合伙伴對NSCLC的致病作用還有待今后證明[11,18,23]。最后，值得注意的是上述不同類型的ROS1基因重排而非ROS1自身突變參與了NSCLC的致病作用，因為在NSCLC中沒有發現任何ROS1激酶結構域有突變產生。相反，在結腸癌、卵巢癌、乳腺癌以及NSCLC非腺癌亞型中出現低頻率的ROS1基因突變，但這些突變的意義尚且未知[11,23]。

3 ROS1融合基因在NSCLC中的臨床特征

圖 1 非小細胞肺癌中ROS1基因重排類型。外顯子E32、E34和E35為ROS1融合基因斷裂部位。TM為ROS1跨膜部分。Fig 1 Type of ROS1 rearrangement in nonsmall cell lung cancer. Exons 32, 34 and 35 are the ROS1 fusion gene splicing domain.TM is transmembrane domain of ROS1.

ROS1基因重排與ALK基因重排在NSCLC中于2007年被同時發現[23]。由于ALK/MET多靶點RTK小分子抑制劑克唑替尼的成功研發，2008年全球首個ALK基因重排臨床治療試驗在美國開始篩選和招募治療NSCLC的ALK基因重排患者[4,34]。盡管在NSCLC中只有3%-7% ALK基因重排，但臨床治療的巨大成功，使得ALK激酶抑制劑克唑替尼快速獲得FDA批準用于EGFR無突變、ALK重排陽性的NSCLC的個體化治療[6]。相反由于沒有相應的ROS1激酶小分子抑制劑，針對ROS1基因重排的NSCLC臨床治療僅在最近相繼報道[12-15]。這得益于體外實驗證明克唑替尼能夠有效抑制含有SLC34A2-ROS1基因重排而無任何ALK重排變異的NSCLC細胞系HCC78的生長及誘導其凋亡[35]。

ROS1基因重排代表一類新的獨特的NSCLC分子亞型，其發生頻率為1%-2%，遠低于EGFR突變（10%-40%）和 ALK重排變異（3%-7%），且存在一定的種族差異[11,36]。但在EGFR/KRAS/ALK均陰性的人群中的發生率則可明顯提高到5.7%[36]。ROS1基因重排陽性與ALK重排陽性的NSCLC患者具有相似性的臨床特征，即為年輕、從不吸煙且為高惡性度趨勢的肺腺癌患者[12,37]。哈佛大學麻省總醫院的Bergethon等[12]分析了18例ROS1陽性患者的臨床資料。結果顯示，NSCLC中ROS1陽性患者與ALK陽性患者的臨床特征有著明顯重疊性，ROS1陽性患者同樣具有患病年齡年輕化（平均年齡49.8歲），從未吸煙的晚期（臨床IV期）肺腺癌患者，而且亞洲患者占多數。此外，ROS1重排陽性的腫瘤多為低分化非典型性浸潤癌。盡管麻省總醫院在案治療的浸潤性NSCLC患者的總生存率（overall survival,OS）在ROS1重排陽性（663天）和陰性患者（607天）之間未見差別，但統計結果顯示，ROS1重排陰性患者的預后較好。國內上海同濟大學周彩存課題組[38]對8例ROS1重排陽性者進行了臨床病例分析發現在中國人群中ROS1重排陰性的患者相比ROS1重排陽性預后好，但是在此小樣本范圍內兩組患者間未能在年齡、性別及有無吸煙史上發現差別。

4 ROS1融合基因的檢測

在各類腫瘤研究領域，基于分子標志物及癌癥驅動基因的研究和臨床試驗取得了明顯進展。EGFR基因突變、ALK基因融合變異、ROS1基因融合等分子靶點及其抑制劑的關系均進一步得到臨床試驗證實。然而，正如ALK基因重排只占肺癌的3%-7%，ROS1基因重排占肺癌比例更低1%-2%，因此，成功篩選病例是使用ROS1抑制劑進行個體化治療成功的關鍵。目前，用于檢測肺癌融合基因方法有多種，主要包括RT-PCR、熒光原位雜交和免疫組組織化學技術。

斷裂熒光原位雜交（break-apart/Split FISH）技術是目前獲得FDA批準的用于檢測ALK融合基因的方法[4]，也是ROS1融合基因臨床檢測的常用方法[12,14,24]。FISH斷裂探針為正常ALK或ROS1基因的5’-和3’-端不同標記有綠色和紅色熒光的探針。正常情況下（無融合基因），這兩個探針雜交結合于同一個基因，在熒光顯微鏡下顯示為接近在一起的綠色和紅色信號或二者重疊在一起的黃色信號。當存在基因重排時，綠色和紅色信號因重組融合伙伴的置換而“斷裂”顯現為分離較遠的單色信號。理論上，FISH適用于檢測任何一種融合伙伴及任何類型基因重排。但是，如果染色體倒位或缺失較小，兩個探針相距小于12M bp，顯微鏡下分裂信號微小，檢測具有挑戰性，因此，針對RT-PCR確診或IHC陽性的融合基因而FISH檢測結果卻出現假陰性。FISH缺點包括相對高的成本，需要專用設備，試劑昂貴，較長的處理時間，以及高水準的專業診斷技術，因而不為大多數臨床病理實驗室所具備。另外，FISH方法不能鑒別融合基因的融合伙伴，是相對較低通量的檢測。Bergethon等[12]應用斷裂FISH技術，對1,073例NSCLC患者進行篩查，發現18例ROS1基因重排病例，陽性率約為1.7%。進一步通過RT-PCR證實含有SLC34A2-ROS1和CD74-ROS1融合基因。Takeuchi等對1,476例日本NSCLC患者使用FISH技術確定了13個ROS1融合基因，陽性率為0.9%（包括CD74-ROS 11例，SLC34A2-ROS 11例，SDC4-ROS 13例，TPM3-ROS 12例，LRIG3-ROS 11例和1例未知）。同樣，Davies等[14]在最近的一項研究中應用FISH技術發現ROS1基因重排陽性率為1.2%（428例中有5例陽性）。

RT-PCR技術簡單快速準確。染色體倒位或缺失融合致使該基因DNA序列具有特殊性，PCR引物只與融合基因轉錄子相結合，從而使得此方法具有高靈敏度，并可確定融合基因的融合伙伴。同時，該方法適用于微量組織標本，比如病人痰標本或用支氣管鏡取得的活檢組織，因而RTPCR技術篩選和確認肺癌基因重組具有獨特的優勢。RTPCR缺點：需要足夠的高質量沒有污染的RNA，這在福爾馬林固定和石蠟包埋的常規腫瘤標本通常很難獲得。此外，大量潛在的ROS1融合蛋白及其變體的存在，則需要足夠大的PCR引物組以涵蓋所有潛在的ROS1重組基因。還有，RTPCR結果常常出現假陽性。因此，該方法難以成為常規臨床檢測方法。上海同濟大學周彩存課題組[38]應用多重RT-PCR技術篩選了392例中國人NSCLC患者的FFPE標本，發現8例ROS1基因重排，重排率約為2.0%。另一項研究[39]對202例中國人肺腺癌患者進行RT-PCR篩選，ROS1陽性率為1%。

免疫組織化學染色在臨床病理實驗室的應用極為普遍，而且免疫組化具有低成本、簡便快速和不失準確性，對包括ALK、ROS1基因重排的患者亞群篩選是一個理想的工具。但IHC對臨床疾病生物標記分子的檢測需要高質量的單克隆抗體，尤其對組織中低水平蛋白表達的檢測。比如，早期使用鼠ALK單克隆抗體來診斷NSCLC患者ALK融合蛋白的檢測效果很不理想，原因是ALK融合蛋白在肺癌中的表達比在ALCL中要低很多。新近采用高敏感高特異的單克隆抗體所進行的IHC染色方法檢測ALK、ROS1基因重排，結果發現與斷裂FISH技術相比，準確度可達到100%，特異性高達99%[25,40]。IHC缺點：IHC染色對不同組織測試點之間存在差別，并且IHC不能區分ROS1野生型和重排型。

總之，雖然FISH是目前肺癌融合基因診斷的金標準，但是每個方法都難免有優點和缺點（表1）。我們應根據每種技術的敏感性、特異性及其檢測局限性將它們應用到臨床檢測中。盡管ROS1基因重排陽性率很低，但如果以臨床病理特征為基礎來檢測ROS1融合基因，在排除EGFR突變、KRAS突變、HER突變、p53突變以及ALK融合變異后，正如EML4-ALK融合基因的檢出率由占全部NSCLC的3%上升到約占25%[41]，ROS1融合變異的檢出率也會大大增加，從而為肺癌個體化治療提供有效的診斷基礎。

5 ROS1靶向治療NSCLC

5.1 ROS1激酶抑制劑 ROS1受體酪氨酸激酶是一個重要的癌癥驅動基因，所以靶向定位抑制它的激酶活性，可以提供更有效的和有選擇性的治療由它衍生出來的癌癥。RTK選擇性抑制劑的研發是當今靶向治療NSCLC領域的一個熱點。早期研發的Staurosporine等能高效抑制ROS1激酶活性（IC50=0.9 nM），但其選擇性較差，因而限制了其臨床應用[42]。AZD1480最近被證明在體外可抑制ROS1激酶活性，在動物體內可明顯縮小ROS1融合所致腫瘤大小，結合其實質為JAK1/2特異性抑制劑，可阻斷STAT3信號通路，從而具有抑制ROS1基因重排誘導的腫瘤發生[43]。再有，El-Deeb等[44]合成了針對ROS1激酶的小分子抑制劑并對其在45種以上不同的受體酪氨酸激酶的抑制作用進行了篩選，發現兩個小分子抑制劑KIST301072和KIST301080具有高特異的抑制ROS1激酶活性（IC50分別為199 nM和209 nM），其臨床前研究尚需進一步得到肯定（表2）。

表 1 ROS1基因重排檢測方法Tab 1 Detection methods of ROS1 rearrangement

表 2 ROS1酪氨酸激酶劑的IC50Tab 2 IC50 of selected ROS1 tyrosine inhibitors

5.2 ALK激酶抑制劑 由于目前針對ROS1酶特異抑制劑的研究尚不成功，而氨基酸序列分析發現，ALK和ROS1激酶結構域間約有49%氨基酸序列同源性，而且ALK和ROS1激酶結構域ATP-結合位點區域的同源性更高達77%[11]。因此，ALK激酶抑制劑可能還抑制ROS1激酶活性。

5.2.1 臨床前研究 在發現NSCLC中存在ALK基因重排后不久，科學家即發現ALK激酶抑制劑對ROS1激酶有抑制作用。McDermott等[35]在對NVP-TAE684（一種特異ALK酪氨酸激酶抑制劑）處理的602個腫瘤細胞系進行篩查時發現，包括NSCLC、神經母細胞瘤和間變性大細胞淋巴瘤細胞系在內的10個腫瘤細胞系對TAE684治療敏感，其中包括SLC34A2-ROS1重排陽性而無任何ALK重排的NSCLC細胞株HCC78[23]，這一結果提供了ALK激酶抑制劑對ROS1酪氨酸激酶有抑制作用的直接證據。隨后的試驗再次證明，TAE684還具有抑制FIG-ROS1融合變異轉染的Ba/F3細胞系[18]。此外，ALK/MET多靶點激酶抑制劑克唑替尼也可適度或全部抑制上述HCC78細胞系或CD74-ROS1轉染的HEK293細胞系[12]、SDC4-ROS1轉染的Ba/F3細胞系[14,25]以及EZR-ROS1轉染的小鼠NIH3T3細胞系[33]。上述研究進一步證明ALK激酶抑制劑的作用機理是可逆性地結合于ROS1激酶結合區，從而抑制了Tyr2774的自身磷酸化，阻斷了激酶活化誘導的下游信號活化通路[11]。

5.2.2 臨床研究 Bergethon等[12]最先成功報道ALK激酶抑制劑克唑替尼治療ROS1重排變異單病例NSCLC患者。患者為31歲年輕男性，從不吸煙，屬腺癌亞型，未見EGFR突變和ALK重排。對厄洛替尼治療無效，且逐步惡化。經額外基因檢測為ROS1重排陽性，并開始克唑替尼標準治療（劑量為250 mg，每日兩次）。不到1周，患者臨床癥狀明顯改善，2周后缺氧消失，8周時CT掃描肺部腫瘤病灶幾乎完全消失。患者繼續用藥6個月無復發跡象。在此基礎上，同一課題組在今年6月的芝加哥2013年ASCO年會上報道了克唑替尼治療ROS1基因重排較大樣本的I期臨床試驗，包括31例ROS1陽性晚期NSCLC患者。在治療8周和16周時患者的疾病控制率分別達到76%和60%。治療總緩解率為56%，包括2例完全緩解，12例部分緩解和8例疾病穩定。6個月無進展生存率達到71%。這表明，克唑替尼對ROS1重排陽性NSCLC患者有明顯治療效果[13]。同樣結果見于另外2例報道，在患者對EGFR-TKI一線治療無效的基礎上，篩查到ROS1重排變異，結果患者對克唑替尼治療8周后出現奇效，其中1例患者證明存在有SDC4-ROS1基因重排[14,15]。克唑替尼對ROS1重排陽性腫瘤患者的臨床療效尚需更大樣本、更多臨床研究單位參與和證實。 隨著新的ALK激酶抑制劑的出現[45,46]，其對ROS1融合變異的NSCLC患者的臨床I期試驗也正在進行中。

以上充分體現了實施快速分子診斷技術發現新的肺癌亞型，以制定針對特定病人的個體化治療的重要性。但這項研究的成功也使得臨床應用分子診斷越來越復雜，從常規檢測的EGFR、KRAS突變，到ALK重排、再到ROS1重排，以及今后包括的新靶點的檢測。目前臨床試驗使用的ROS1基因重排的各種檢測方法尚未得到商業化。

6 展望

以分子分型為基礎的腫瘤靶向治療代表了腫瘤治療的最新發展方向，而根據基因檢測進行分子分型、進而合理選擇治療方案實施個體化療必將成為今后肺癌臨床治療的主流。ROS1重排陽性作為一個新的NSCLC分子亞型，雖然罕見，但已經成為一個有效的治療靶點，并期待今后臨床試驗結果給予更完善更全面的佐證。未來的工作將包括檢測ROS1融合變異的最佳方法、完善ROS1重排陽性腫瘤的治療群、鑒定ROS1融合蛋白下游信號通路、發現ROS1 RTK抑制劑出現抵抗的機理以及研發新的特異性ROS1酪氨酸激酶抑制劑。