西妥昔單抗聯(lián)合塞來昔布對肺腺癌細胞KDR和AQP1表達的影響

夏洪剛 葉劍飛 白宏宇 王長利

肺癌是人類高發(fā)的惡性腫瘤，病死率在惡性腫瘤中居首位，其治療失敗和死亡的主要原因肺癌的侵襲和轉移，新生血管的生成在肺癌的侵襲和轉移中起著極其重要的作用[1,2]。近年來研究[3-6]表明水通道蛋白1（aquaporins 1, AQP1）和血管內皮生長因子受體II/激酶功能區(qū)受體（vascular endothelial growth factor II , VEGFR2/kinase domain receptor, KDR）在許多腫瘤及其血管內皮細胞均有表達升高，在促進血管生成和腫瘤細胞增殖中起著關鍵作用。本研究以肺腺癌A549細胞株為研究對象，觀察表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）單克隆抗體西妥昔單抗、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）抑制劑塞來昔布單獨及聯(lián)用時對體外肺腺癌A549細胞增殖和凋亡及KDR、AQP1基因和蛋白表達的影響，探討兩者的協(xié)同關系及其機制，以期為臨床治療肺癌提供新思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞究所。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司。SPB購自德國Merck公司，塞來昔布（Celecoxib，江蘇恒瑞制藥有限公司），西妥昔單抗（Cetuximab，德國默克公司），青霉素（100 U/mL）（北京化工廠），鏈霉素（100 U/mL）（Peprotech），5%四甲基偶氮唑藍（MTT溶液，上海華美生物工程公司）；流式細胞儀（COULTER XL, Coulter）；550酶標儀（美國Biorad公司），生物倒置顯微鏡（Olympus CKX4）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞研究所，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5%CO2、37oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞以1×106個/100 mL培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)24 h后如下分組進行藥物處理，實驗分組：對照組（PBS液1 mL處理組）；西妥昔單抗1 nmol/L組；塞來昔布25 μmol/L組；西妥昔單抗1 nmol/L+塞來昔布25 μmol/L組，藥物濃度見參考文獻[7,8]。

1.2.2 MTT比色實驗 在96孔板上按5×104個/孔接種A549細胞，如1.2分組，每組設三個平行重復孔，置于37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，生理鹽水漂洗一遍，每孔加MTT 20 μL（濃度為5 mg/mL），放置孵箱內4 h后棄上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸鈉）200 μL，過夜。震蕩15 min，用全自動酶標儀（美國Biorad公司）檢測570 nm處的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A對照組-A實驗組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 收集如1.2分組的不同處理組細胞，調整細胞濃度為1×106個/L，冷PBS 洗滌2次，加入70%的冷乙醇（4oC）固定24 h。洗滌細胞，與含10 μg/mL RNA 酶的Tris-HCL緩沖液（pH7.4）共同孵育30 min。50 μg/mL碘化丙啶進行細胞DNA染色，1 h內通過流式細胞儀（COULTER XL, Coulter）；分析細胞DNA含量分布，計算出各個周期細胞的百分率。

1.2.4 Transwell小室侵襲實驗 在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按如1.2分組處理過的A549細胞懸液100 μL（細胞總數(shù)為3×105個/L），置于培養(yǎng)箱中20 h后取出，用濕棉簽仔細擦掉上室中未穿過的瘤細胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗3遍，進行HE染色，自然涼干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上（膜內面朝上），封片；高倍顯微鏡下記數(shù)穿膜的A549細胞數(shù)，每膜記數(shù)上、下、左、右、中5個視野的侵襲細胞數(shù)，計算平均值，每組設三個濾膜。

1.2.5 RT-PCR檢測KDR、AQP1基因表達 將各組處理后的細胞懸液分別經離心半徑16 cm、 800 rpm、離心5 min收集細胞，棄去上清后置于1 mL勻漿器中，加入1 mL Trizol試劑后研磨（冰盒上操作）。進行RT-PCR分析。采用Trizol（Takara公司）試劑說明書介紹的方法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量，以總RNA為模板、Oligo（dT）為引物, 應用RT-PCR兩步法試劑盒（TaKaRa公司）將mRNA逆轉錄成cDNA，反應參數(shù)：30oC、10 min→2oC、30 min→99oC、5 min→5oC、5 min。所得cDNA -20oC保存。以反轉錄所得cDNA為模板，相關引物序列見表1。上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL體系。擴增參數(shù)：94oC、2 min→（94oC、30 s→55oC、30 s→72oC、30 s）×45循環(huán)→72oC、5 min。取PCR產物經瓊脂糖電泳后用FR200圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.6 Western blot檢測KDR、AQP1蛋白表達 在RT-PCR提取后剩余物中，加入適量裂解液及蛋白酶抑制劑，4oC、以1,500 rpm離心30 min，取上清液。用考馬斯亮藍法測定蛋白含量后。將5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉14 V恒壓14 h，37oC搖床封閉2 h，洗膜10 min，3次，轉印后加入一抗：KDR多克隆抗體（1:1,000）或AQP1多克隆抗體4oC過夜（1:1,000）；抗鼠β-actin（1:5,000）4oC過夜。次日加入二抗山羊抗兔抗體（1:700），37oC搖床孵育1.5 h，TTBS洗3次×5 min，TBS洗3次×5 min。將硝酸纖維素膜用發(fā)光液（Pierce，A、B各100 μL）充分潤濕后作用5 min，保鮮膜覆蓋，置暗盒中曝光5 min。顯影、水洗、定影后觀察結果，Quantity one圖像分析。目的條帶灰度值除以β-actin灰度值進行結果分析。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequences

表 2 各組A549細胞OD490值（Mean±SD, n=9）Tab 2 OD490 value after Cetuximab and Celecoxib inhibit A549 (Mean±SD, n=9)

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以Mean±SD表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，協(xié)方差校正，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 肺腺癌A549細胞在光學顯微鏡觀察，可見細胞生長旺盛，分布密集，大多呈多角形，細胞走向趨于一致，多角形細胞的胞體飽滿、有2個-3個扁平而長的突起，細胞核較大，呈卵圓形且多居中（圖1）。

2.2 各組A549細胞經處理后的OD490值 從表2 可以看出：Cetuximab單藥處理組抑制率為（30.6±1.2）%；Celecoxib單藥處理組抑制率為（29.8±1.4）%；而Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯(lián)用的效果，抑制率為（61.4±2.2）%。說明兩者聯(lián)合作用具有協(xié)同效應。

圖 1 A549細胞光學顯微鏡下形態(tài)（×200）Fig 1 A549 morphology under the light microscope (×200)

2.3 流式細胞術測定細胞周期分布 如表3所示，Cetuximab組、Celecoxib組和Combination組G1期細胞明顯多于對照組，Combination組明顯多于Cetuximab 組和Celecoxib組，而S期細胞相應減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），M期細胞無明顯變化。表明Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯(lián)用的效果優(yōu)于單獨用藥。

2.4 A549細胞體外侵襲力的變化 如圖2所示，對照組A549細胞穿過濾膜的細胞數(shù)量較多，Cetuximab組、Celecoxib組穿膜細胞數(shù)明顯減少，Combination組穿膜細胞數(shù)最少。實驗結果表明Cetuximab 1 nmol/L+Celecoxib 25 μmol/L組兩藥聯(lián)用能更有效地降低A549細胞的侵襲力。

表 3 對各組549細胞周期的影響（Mean±SD, n=3）Tab 3 Cetuximab and Celecoxib effect on A549 cell cycle (Mean±SD, n=3)

圖 2 不同處理組處理后A549細胞侵襲能力的影響。和對照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 2 Changes of invasion ability of A549 cells in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group,△P＜0.05.

2.5 AQP1、KDR mRNA表達 經過相關處理后，AQP1 mRNA、KDR mRNA在Combination組表達量較Cetuximab組、Celecoxib組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.6 AQP1、KDR蛋白表達 給予相關處理后各組AQP1、KDR蛋白表達表達如下（圖4），經過相關處理后，AQP1、KDR蛋白在Combination組表達量較Cetuximab組、Celecoxib組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖 3 各組細胞AQP1 mRNA、KDR mRNA表達變化。與對照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 3 Changes of AQP1 and KDR mRNA levels in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group, △P＜0.05.

圖 4 各組細胞AQP1蛋白、KDR蛋白表達變化。與對照組比較，*P＜0.05；與Combination組比較，△P＜0.05。Fig 4 Changes of AQP1 and KDR protein levels in each group cells. Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Combination group, △P＜0.05.

肺癌是一種臨床常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率己占癌癥死亡率之首，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占了到肺癌的85%以上。肺癌的侵襲和轉移是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。而腫瘤血管的生成在腫瘤的浸潤和轉移過程中起著至關重要的作用[9]。因為腫瘤的持續(xù)生長必須依賴新生血管生成，大量的新生血管形成是體積＞2 mm的腫瘤繼續(xù)生長不可缺少的因素，沒有足夠的新生血管提供充足的養(yǎng)分，腫瘤的生長潛能將嚴格受到限制[10,11]。

近年來的研究[12,13]表明KDR及AQP1與腫瘤血管生成關系密切，不僅在血管內皮細胞表達KDR及AQP1，而且腫瘤細胞亦能表達。其中AQP1是腫瘤血管生成的一種新的促進因子，被認為是血管增生的一種標記物。目前大量研究表明許多腫瘤組織、癌細胞系及微血管內皮細胞中AQP1呈高度表達[14,15]，并且其表達量與腫瘤惡性程度有直接關系，惡性程度越高，AQP1表達量越高[16]，提示應用水通道蛋白（aquaporins, AQP）的抑制劑或抗AQP抗體降低AQP1的表達將會是新的治療肺腺癌手段。KDR也是腫瘤血管生成過程中主要的調控因子之一[17]。腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），除了以旁分泌的形式作用于血管內皮上的KDR，促進血管形成外，還以自分泌的方式作用于自身細胞上的KDR，直接促進腫瘤細胞生長。另外研究發(fā)現(xiàn)阻斷KDR表達可誘導腫瘤細胞凋亡。因此，抑制KDR表達，不僅可抑制腫瘤血管生成，而且也可阻止腫瘤細胞的生長從而阻斷肺癌的生長和轉移。故以KDR為靶點抑制血管生成進而控制腫瘤生長，對腫瘤治療和防止腫瘤遠處轉移也有重要意義。

近年來研究[18]表明，COX-2抑制劑塞來昔布對多種腫瘤細胞有抑制增殖、誘導分化、促進凋亡作用；西妥昔單抗是一種腫瘤分子靶向藥物，也廣泛應用于基礎和臨床研究[19,20]。本實驗將兩者聯(lián)合應用于A549細胞的體外培養(yǎng)，探討兩者對A549細胞KDR及AQP1表達的影響及對腫瘤細胞的抑制效果。研究發(fā)現(xiàn)在A549細胞系的體外作用中，西妥昔單抗和塞來昔布都具有一定的抑瘤效應，聯(lián)合應用時，二者具有明顯的協(xié)同效應，可進一步抑制細胞的生長和遷移。西妥昔單抗和塞來昔布單藥作用于A549細胞能夠明顯降低AQP1和KDR基因和蛋白的表達水平，兩藥聯(lián)合時降低AQP1和KDR基因和蛋白表達的作用更加明顯。提示降低AQP1 和KDR基因和蛋白的表達可能是兩者協(xié)同作用的分子機制之一。具體機制本研究分析認為與兩種藥物分別通過抑制COX-2及抗腫瘤作用改善微環(huán)境，進而使AQP1和KDR基因和蛋白表達降低。西妥昔單抗和塞來昔布聯(lián)合作用后細胞凋亡率更高（P＜0.01）；聯(lián)合用藥與單獨用藥相比，可使細胞發(fā)生明顯的G1期阻滯（P＜0.01），細胞侵襲力明顯降低。本研究顯示將西妥昔單抗和塞來昔布聯(lián)合應用于肺腺癌的治療效果更佳，能夠為臨床提供有益的思路。