LPS誘導下THP－1細胞基因表達內參基因的篩選1）

梁俊紅，曹錫梅，萬東方，張 潮，郭大瑋

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管疾病的主要病理基礎，引起AS的病因很復雜。巨噬細胞在其發生、發展過程中有重要作用[1，2]。抑制巨噬細胞的炎癥反應有可能成為預防和治療AS的一個重要的方向。已知人單核白血病（THP－1）細胞具有單核細胞和巨噬細胞的功能和生理學特性，被廣泛用于毒理學、免疫學和動脈粥樣硬化等研究領域[3]。而G－細菌細胞膜的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以刺激單核巨噬細胞系統發生免疫反應[4]。明確LPS刺激THP－1細胞的基因轉錄水平將有助于揭示AS的病因。

實時定量PCR（RT－qPCR）較普通PCR定量準確、重現性好、靈敏度高，已經成為分析基因轉錄水平的首選方法[5－7]。然而，多種變量因素影響其數據處理和結果分析，如提取RNA的質量、酶的效率（反轉錄效率，擴增效率）等等。為了去除這些變量可能存在的差別而獲得目標基因特異性表達的真正差異，實驗者通常選擇表達穩定的單一內參基因GAPDH或ACTB進行校正和標準化。然而越來越多的研究表明，某些條件下穩定表達的內參基因變得不再穩定[8，9]。為了確保RT－qPCR結果的可靠性，Bustin等[10]針對實驗中的種種問題提出一套標準指南（MIQE指南）。本研究依據該標準指南共選取10個候選看家基因：ACTB、GAPDH、RPL37A、PPIB、PGK1、PPIA、SDHA、TBP、HPRT1、RPL13A ，通過 SYBR－Green RT－qPCR技術對LPS刺激THP－1細胞的基因轉錄水平進行檢測，評估不同條件下適合此細胞基因表達水平研究的內參基因，以確保后期RT－qPCR實驗結果的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 THP－1細胞培養與樣本采集 THP－1細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（TCHu－57），用含10%FBS（Gibco 10099－141，購自北京茂建）的 RPMI－1640（Hyclone，SH30809.01B）培養基，37℃，5%CO2的細胞培養箱培養。穩定培養傳2代～3代后給予Lipopolysaccharide（LPS，Sigma，L2880，10μg／mL）刺激。實驗設計LPS刺激 THP－1細胞不同時間點：LPS刺激0h、2h、6h、12h、24h。

1.2 總RNA提取純化與反轉錄 依照說明書使用TransZol Up（ET111－01，北京全式金生物技術有限公司）抽提上述5個時間點THP－1細胞的總RNA，DNaseI（D2215，TaKaRa大連寶生物工程有限公司）去除基因組DNA的污染，紫外分光光度計測定每個樣本RNA的濃度與純度。參照反轉錄PrimeScriptTM－reagent kit（DRR037S，TaKaRa大連寶生物工程有限公司）說明書，以400ng總RNA為模板合成cDNA，同時設陰性對照。

1.3 實時定量PCR 實驗中涉及的所有內參基因的基因序列均來自于GenBank。采用Allele ID6對序列進行分析，并設計適合于SYBR Green的特異性上、下游引物（見表1），委托上海英駿公司（Invitrogen）合成。RT－qPCR反應總體系為20μL，包括2×SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）10μL、ROX 0.2μL、10 μmol／L上下游引物各0.4μL、cDNA模板1μL、ddH2O補齊余體積。Stratagene實時熒光定量儀Mx3000p運行，反應條件為95℃預變性5s、95℃變性5s、55℃退火30s、72℃延伸30 s并收集熒光，40個循環，57℃～95℃生成熔解曲線。每個樣品3次重復。經過Mx3000p軟件分析，可以得到各內參基因的循環閾值（Ct）。

表1 RT－qPCR中所用候選看家基因引物

1.4 實時定量PCR擴增效率的驗證 以cDNA第一鏈為模板，做梯度稀釋。依次做5個梯度稀釋后cDNA初始濃度分別為1／10、1／102、1／103、1／104、1／105。每個反應重復2次，通過RT－qPCR分析相關系數，擴增效率等通過Stratagene實時熒光定量PCR儀Mx3000P自帶軟件得到。

1.5 數據分析 根據qRT－PCR定量分析結果，利用GeNorm和NormFinder軟件對各候選內參基因在LPS刺激不同時間后的表達穩定性進行統計學分析，從而篩選出最優的內參基因。

2 結 果

2.1 內參基因引物特異性 普通PCR擴增、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測每個內參基因引物的特異性，結果如圖1所示，各引物條帶清晰，擴增產物片段大小正確。各內參基因的溶解曲線均為單一峰，證明內參基因引物特異性良好。

圖1 10個候選內參基因1%瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 熒光定量PCR的效率（見表2） 10個候選內參基因的標準曲線R2值變化范圍為0.990～0.999，表明cDNA初始模板量與其相應的Ct值線性關系較好。

表2 10個候選內參基因標準曲線斜率、相關系數及PCR擴增效率

2.3 NormFinder軟件分析 5個樣本經10個候選基因的特異性引物擴增后，Ct值分布如圖2所示，由圖可知GAPDH、PGK1Ct值比較穩定。

經GenEx軟件中Normfinder分析，10個候選內參基因的組內標準差如圖3所示，經過分析，Normfinder選擇GAPDH（SD＝0.0951）為最佳基因，說明在分析LPS刺激后THP－1細胞mRNA的表達量時GAPDH的變化最小，而RPL13A（SD＝1.539 4）最不穩定。

圖2 候選內參基因經Normfinder分析后穩定性排列

2.4 GeNorm軟件分析結果 Genorm軟件通過分析內參基因在不同樣品中的表達穩定性（M）來確定最穩定的內參基因，但該程序基于標準差，默認M＝0.5為取舍值。若某內參基因的M值小于0.5，可考慮將其作為內參基因。M值越大表示其穩定性越差；反之，穩定性越好。由圖3可知，候選內參基因的穩定性為GAPHD＝PGK1＞PPIB＞RPL37A＞HPRT1＞ACTB＞PPIA＞SDHA＞TBP＞RPL13A。GAPDH、PGK1穩定性好，適合作為LPS刺激下THP－1細胞基因表達分析的內參基因。

表3 GeNorm軟件分析候選內參基因在LPS刺激THP－1不同時間后的表達穩定性

3 討 論

RT－PCR是分析基因轉錄水平的首選方法，為了確保其結果的準確性和可靠性，選擇合適的內參基因是非常重要的一個環節。內參基因通常是各種看家基因，在細胞內組成性表達，有助于保持細胞的功能。由于內外環境的變化，在細胞內真正恒定表達的基因并不存在。RT－PCR實驗中選擇的理想內參基因應該滿足以下條件：①不存在假基因，避免基因組DNA的擴增；②表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關；③穩定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細胞和癌細胞），且其表達量是近似的，無顯著性差別；④高度或中度表達，排除太高或低表達；⑤其穩定的表達水平與目標基因相似；⑥不受任何內源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。實際上能滿足這些條件的基因幾乎是不存在的，目前所研究的基因（包括看家基因）在不同類型的細胞、組織及實驗條件下表達均有差異[11]，研究者有必要針對不同的實驗條件、分析尋找適合各自實驗系統的特異性穩定表達的內參基因。

本研究依據MIQE指南共選取10個候選看家基因，采用NormFinder和GeNorm軟件評估不同條件下適合THP－1細胞基因表達水平研究的內參基因。NormFinder軟件經標準曲線或ΔCt法將原始數據轉換成線性表達量，然后通過方差分析得出基因的表達穩定值 M，可以直接評價基因的穩定性[12]。GeNorm軟件是通過分析內參基因的表達穩定值來篩選內參基因[13]。原始數據先經 2– ΔCt（EMinCt－SampleCt）法轉換成相對表達量輸入Excel表格，GeNorm軟件將每個候選內參基因與其他候選基因的配對表達水平比值進行對數變換，計算出標準差作為基因表達穩定值M，然后對所有候選內參基因的表達穩定性排序。根據NormFinder和GeNorm軟件分析得出本實驗中GAPDH和PGK1是表達最穩定的內參基因。RT－PCR進行基因轉錄分析中選擇一個以上的內參基因作內參可以得到更可靠的結果[14]，為確保后期RT－qPCR實驗結果的準確性和可靠性，同時選用GAPDH和PGK1校正目的基因表達。

總之，RT－PCR實驗中研究者應該根據細胞和組織的類型及不同實驗條件，選擇最合適的內參基因，選擇2個或2個以上的內參基因將有助于得到更可靠的結果。

[1]Davis NE.Atherosclerosis－－an inflammatory process[J].J Insur Med，2005，37（1）：72－75.

[2]Breland UM，Michelsen AE，Skjelland M，etal.Raised MCP－4levels in symptomatic carotid atherosclerosis：An inflammatory link between platelet and monocyte activation[J].Cardiovasc Res，2010，86（2）：265－273.

[3]Auwerx J.The human leukemia cell line，THP－1：A multifaceted model for the study of monocyte－macrophage differentiation[J].Experientia，1991，47（1）：22－31.

[4]Brandtzaeg P，Bjerre A，Ovstebo R，etal.Neisseria meningitides lipopolysaccharides in human pathology[J].J Endotoxin Res，2001，7（6）：401－420.

[5]Bustin SA，Benes V，Nolan T，etal.Quantitative real－time RTPCR －aperspective[J].J Mol Endocrinol，2005，34（3）：597－601.

[6]Kubista M，Andrade J M，Bengtsson M，etal.The real－time polymerase chain reaction[J].Mol Aspects Med，2006，27（2－3）：95－125.

[7]VanGuilder HD，Vrana KE，Freeman WM.Twenty－five years quantitative PCR for gene expression analysis[J].Biotechniques，2008，44（5）：619－626.

[8]Bustin SA.Absolute quantification of mRNA using real－time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J Mol Endocrinol，2000，25（2）：169－193.

[9]Thellin O，Zorzi W，Lakaye B，etal.Housekeeping genes as internal standards：Use and limits[J].J Biotech，1999，75（2－3 ）：291－295.

[10]Bustin SA，Benes V，Garson JA，etal.The MIQE guidelines：Minimum information for publication of quantitative real－time PCR experiments[J].Clin Chem，2009，55（4）：611－622.

[11]Lee PD，Sladek R，Greenwood CM，etal.Control genes and variability：Absence of ubiquitous reference transcripts in diverse mammalian expression studies[J].Genome Res，2002，12（2）：292－297.

[12]Andersen CL，Jensen JL.Normalization of real－time quantitative reverse transcription－PCR data：A model－based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets[J].Cancer Res，2004，64（15）：5245－5250.

[13]Vandesompele J，De PK，Pattyn F，etal.Accurate normalization of real－time quantitative RT－PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3（7）：1－11.

[14]Schmid H，Cohen CD，Hanger A，etal.Validation of endogenous controls for gene expression analysis in microdissected human renal biopsies[J].Kidney Int，2003，64（1）：356－360.