血腦屏障通透性在外傷性癲癇大鼠中的作用機制研究

劉明剛，朱 權(quán)，孫美珍，孫 洋，李 偉

外傷性癲癇（post－traumatic epilepsy）是指腦組織從腦外傷開始，經(jīng)過一定的潛伏期，產(chǎn)生了慢性、復發(fā)性、自發(fā)性癲癇發(fā)作的過程，外傷性癲癇是最適合研究人類癲癇發(fā)生機制的模型[1]。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，50%以上病人由各種腦損害引起，即癥狀性癲癇，而腦外傷后發(fā)生癲癇的危險性比正常人高3倍以上，其發(fā)生率為4%～53%，占癥狀性癲癇的首位[2]。外傷性癲癇的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，最近的臨床和動物實驗研究表明血－腦屏障（BBB）的破壞在外傷性癲癇的發(fā)病機制中起了關鍵作用[3]。本實驗通過自由落體損傷模型分析外傷性大鼠血腦屏障破壞程度與癲癇發(fā)作的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雌雄性各半SD大鼠62只，體重200g～250g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗前動物均在實驗環(huán)境下飼養(yǎng)1周，給予適宜溫度（23℃～25℃）和24h光照／暗周期，允許自由飲食。將其隨機分為3組：空白對照組10只，不給損傷處理；甘露醇應用組26只，給予頭部損傷處理，在頭部損傷后24h內(nèi)，用25%甘露醇注射液1.5g／kg尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3d，以提高血腦屏障的滲透性；模型對照組26只，給予頭部損傷處理，用等體積生理鹽水尾靜脈注射，在頭部損傷后24h內(nèi)應用，每天應用1次，連續(xù)用3d。空白對照組再分為兩組分別飼養(yǎng)3d和3個月，每組5只；甘露醇應用組和模型對照組再分別各分為3組，飼養(yǎng)3d和7d各8只，飼養(yǎng)3個月各10只。

1.2 動物模型的制備 將SD大鼠用10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頂部去毛，消毒，沿正中線切開頭皮暴露顱骨，長度約1.5cm，在矢狀縫右側(cè)，據(jù)前囟0.15cm，矢狀縫0.25cm處為中心開骨窗，直徑為0.4cm，但不損傷硬膜，然后將大鼠連到自由落體打擊裝置上，釋放重錘，根據(jù)吳旭等[4]研究制作成重型顱腦損傷模型。打擊后切口內(nèi)注入40 000U慶大霉素注射液0.5mL預防感染，縫合頭皮。空白對照組僅開顱窗不施加打擊。

1.3 方法

1.3.1 BBB通透性測定 飼養(yǎng)3d和7d的大鼠用于血腦屏障通透性的測定。伊文氏藍（EB）的滲出量與血腦屏障的開放程度成正相關，應用分光光度計在EB最大吸收光譜635nm處檢測腦組織中的EB含量，可以作為判斷血腦屏障開放程度的一種定量指標，其腦組織EB含量亦代表血清白蛋白的滲出量[5]7μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL、6μg／mL、8 μg／mL、10μg／mL為EB標準濃度，繪制伊文氏藍標準曲線。

1.3.2 行為學觀察 飼養(yǎng)3個月的大鼠用于行為學觀察。采用人工觀察和視屏監(jiān)測大鼠24h活動，按Racine’s分級（0級，無驚厥；1級，閉眼、胡須動，口、鼻、面肌陣攣；2級，在1級基礎上出現(xiàn)節(jié)律性點頭；3級，在2級基礎上出現(xiàn)前肢陣攣；4級，在3級基礎上出現(xiàn)后肢站立；5級，在4級基礎上出現(xiàn)跌倒發(fā)作）記錄大鼠癲癇發(fā)作情況。

1.3.3 腦電圖采集 模型建立后觀察發(fā)現(xiàn)有類似癲癇發(fā)作2次以上的大鼠進行腦電圖信息采集，將大鼠用20%烏拉坦注射液（5mL／kg）麻醉，固定于腦立體定位儀上，用電生理信號采集儀描記大鼠皮層腦電活動，當出現(xiàn)重復暴發(fā)性棘波、棘慢復合波或尖波等癲癇樣放電波幅超過基線的兩倍并持續(xù)5s以上時確定為EEG發(fā)作。

1.3.4 標本制作 10%水合氯醛注射液3mL／kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于解剖板上，劍突下開胸，從心尖部將穿刺針向主動脈方向插入，剪開右心耳，用300mL生理鹽水灌注沖洗，接著用4%的多聚甲醛200mL～300mL灌注，在整個灌注過程中可以觀察到大鼠全身肌肉顫動，而后逐漸僵硬、強直，再將腦組織完整取出，浸泡于4%多聚甲醛中后固定，4℃冰箱保存，1周內(nèi)切片。每塊厚約2mm，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋后作連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，每隔2張取1張切片，每例標本取切片不少于8張。

1.3.5 免疫組化染色（SABC法） 切片常規(guī)脫蠟至水，用0.3%H2O2室溫處理5min～10min以滅活內(nèi)源性酶，入0.01 mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中微波抗原修復10min，再次PBS漂洗后入5%BSA封閉液，室溫20min，后按ABC法行抗GFAP免疫組織化學反應。依次孵育于兔抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體稀釋液（1∶200），37℃1h；生物素化山羊抗兔IgG（1∶150）37℃20min；SABC（1∶150）37℃20min。以上每一步驟之后均用0.01mol／L PBS（pH7.2～7.6）漂洗5min×3次。蘇木素輕度復染，脫水、透明和封片，顯微鏡觀察。以上試劑均購于博士德生物試劑公司。

1.3.6 星形膠質(zhì)細胞計數(shù) GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志物，其表達水平可代表星形膠質(zhì)細胞增生的情況[6]7倍光鏡下對海馬結(jié)構(gòu)進行GFAP免疫反應陽性細胞計數(shù)，每只鼠各取三張切片，每張切片隨機選擇5個不重復視野取平均值，同時觀察該區(qū)域GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)。利用Image Pro Plus 5.0圖像分析軟件分析，取每張切片中GFAP陽性細胞的積分光密度（IOD）平均值。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗進行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠死亡情況 空白對照組無死亡；甘露醇組死亡8只，存活18只；模型對照組死亡7只，存活19只。總死亡率為28.8%（15／52）。

2.2 3組EB含量比較 模型建立后3d和7d，甘露醇應用組、模型對照組與空白對照組損傷側(cè)皮層EB濃度比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），甘露醇應用組和模型對照組EB比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 3組大鼠皮層EB濃度（±s） μg／g

表1 3組大鼠皮層EB濃度（±s） μg／g

組別 損傷側(cè)皮層對側(cè)皮層3d 7d 3d 7d空白對照組 5.83±1.19 5.83±1.19 5.79±1.26 5.79±1.26模型對照組 65.40±9.271） 16.64±1.921） 6.83±1.37 5.54±0.58甘露醇應用組 83.73±8.321）2） 19.44±2.351）2） 12.23±0.89 6.75±2.31與空白對照組，1）P＜0.01；與模型對照組比較，2）P＜0.01

2.3 行為學及腦電圖觀察 空白對照組未觀察到癲癇發(fā)作；實驗組早期24h至7d內(nèi)有10只大鼠可以觀察到閉眼、胡須動、面肌痙攣和節(jié)律性點頭等癥狀。模型建立7d后，3個月內(nèi)模型對照組存活的7只大鼠中有2只出現(xiàn)面積痙攣、節(jié)律性點頭癥狀，持續(xù)時間10s～30s；甘露醇組存活的7只大鼠中有2只出現(xiàn)面積痙攣、節(jié)律性點頭癥狀，1只出現(xiàn)前肢陣攣，本實驗未觀察到3級以上的發(fā)作。甘露醇組與模型對照組癲癇發(fā)作的大鼠數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組大鼠腦電圖以9Hz～12Hz的α波或17Hz～19Hz的β波為主，波幅20 μV～80μV。慢性期癲癇大鼠EEG表現(xiàn)為背景節(jié)律增快，波幅為150μV～300μV，能觀察到明顯的棘波、尖波等。

2.4 GFAP陽性細胞形態(tài)觀察和計數(shù) 鏡下觀察可見皮層內(nèi)被染成棕褐色GFAP的免疫反應陽性細胞呈彌散分布，細胞胞體腫脹，界限清晰，數(shù)量增多，突起增粗，胞核被蘇木素復染為深藍色，較小，居于細胞中央或偏位。對照組大鼠GFAP陽性細胞胞體較小，突起少而細。各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細胞數(shù)及IOD值見表2。甘露醇應用組、模型對照組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細胞數(shù)及IOD值與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），甘露醇組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細胞數(shù)及IOD值（±s）

表2 各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽性細胞數(shù)及IOD值（±s）

分組 n 平均陽性細胞數(shù) 積分光密度（IOD）空白對照組 5 30.14±3.86 1289±368.45模型對照組 7 46.86±5.331） 2649±348.591）甘露醇應用組 7 52.76±6.521）2） 3210±398.241）2）與空白對照組，1）P＜0.01；與模型對照組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本研究我們通過自由落體致重型顱腦損傷模型研究血腦屏障破壞與癲癇發(fā)作之間的關系，給予1 200g＊cm的打擊力度造成重型顱腦損傷，損傷的程度越大動物死亡率越高，中重度顱腦損傷死亡率高達30%～40%[7]，本實驗大鼠的死亡率為28.8%（15／52），與文獻報道相近。實驗組分別給予尾靜脈注射生理鹽水和甘露醇后發(fā)現(xiàn)，甘露醇能進一步開放血腦屏障（P＜0.01），但3個月期間觀察兩組大鼠的致癲癇率無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），分析認為一方面是由于樣本數(shù)量較少，另一方面是觀察周期的限制，研究認為大鼠外傷后需經(jīng)過大約6周至11個月，平均7個月才會有約50%的大鼠產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作[8]。但兩組星形膠質(zhì)細胞數(shù)比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明血腦屏障開放程度越大，膠質(zhì)細胞增生越明顯。

外傷后往往出現(xiàn)血腦屏障的破壞[9]，近年來，血腦屏障的破壞被認為在癲癇形成過程中發(fā)揮重要作用[10]7年Cornford等[11]首先通過觀察超微結(jié)構(gòu)研究了血腦屏障與癲癇的關系，隨后的試驗也證實了血腦屏障破壞后經(jīng)過一定潛伏期能夠誘發(fā)癲癇發(fā)作[12]，van Vliet等[10]用甘露醇人為造成血腦屏障開放，發(fā)現(xiàn)已患有慢性癲癇的大鼠其發(fā)作頻率較前明顯增加，這提示血腦屏障通透性的改變可能是癲癇發(fā)作的重要機制。進一步的研究發(fā)現(xiàn)血腦屏障破壞后白蛋白滲出在癲癇的發(fā)生中起了重要作用，本研究也證實血腦屏障開放后能夠引起白蛋白滲出，而且開放程度越大，白蛋白滲出量越多，白蛋白外溢導致腦組織直接暴露于血清白蛋白足以引起癲癇發(fā)生[13]，且白蛋白引發(fā)的癲癇活動強度表現(xiàn)為劑量依賴式[14]。而白蛋白滲出后是如何引起癲癇發(fā)作的，Tomkins等[15]認為無論是血腦屏障破壞還是將白蛋白直接暴露于腦組織，都會引起膠質(zhì)細胞激活，使其對鉀離子的緩沖減弱，細胞外K＋增高，導致神經(jīng)元過度興奮。Cacheaux等[16]研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白溢出到腦組織后通過轉(zhuǎn)化生長因子β受體（TGF－βRs）被膠質(zhì)細胞攝取，引起鉀內(nèi)向整流通道（Kir4.1）表達減少，細胞外鉀離子積累增加，導致N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA）受體介導的神經(jīng)興奮性增高，最終引發(fā)癲癇樣活動[17]。血腦屏障破壞后，損傷處的腦組織就開始進行一系列的病理變化：神經(jīng)元壞死和膠質(zhì)細胞增生[3]，而這些膠質(zhì)細胞反應性改變稱為反應性星形膠質(zhì)細胞增生，一般涉及星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的變化和數(shù)量增加[18]，本研究也證實血腦屏障破壞后，會出現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞形態(tài)和數(shù)量的變化，而且血腦屏障開放程度越大，膠質(zhì)細胞增生的數(shù)量越多。星形膠質(zhì)細胞的激活是其增生的基礎，星形膠質(zhì)細胞增生可能導致神經(jīng)細胞外Na＋／K＋濃度平衡失調(diào)，使神經(jīng)細胞興奮的閾值降低，神經(jīng)活動過度而發(fā)生癲癇[19]。Vessal等[20]給已經(jīng)發(fā)生癲癇的大鼠分別注射生理鹽水和L－AA（一種阻斷星形膠質(zhì)細胞增生的氨基酸）觀察發(fā)現(xiàn)，給予阻斷星形膠質(zhì)細胞增生后，大鼠癲癇發(fā)作程度明顯減輕，這提示星形膠質(zhì)細胞的增生在癲癇反復發(fā)作中起著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在腦外傷后的1周左右可觀察到大鼠點頭、面肌痙攣等癲癇樣癥狀，推測與BBB破壞后早發(fā)性神經(jīng)元異常放電有關[21]，癲癇發(fā)作可發(fā)生在外傷后早期，但外傷性癲癇需在外傷后數(shù)月甚至數(shù)年才會發(fā)生[15]，然而早發(fā)性癲癇的出現(xiàn)卻可以大大增加患者發(fā)生晚發(fā)性癲癇的風險[22]。外傷性癲癇指外傷后1周出現(xiàn)的反復自發(fā)性癲癇發(fā)作，又稱遲發(fā)型癲癇，以區(qū)別1周內(nèi)發(fā)生的早發(fā)行癲癇或24h內(nèi)出現(xiàn)的即時發(fā)作性癲癇，但這種定義在動物模型中尚未定義[8]。在人類外傷后早發(fā)性癲癇的發(fā)生率約為2.1%～16.9%，以兒童多見[2]。

血腦屏障破壞后引起血清白蛋白外滲到腦組織，血清白蛋白通過轉(zhuǎn)化生長因子β受體被膠質(zhì)細胞攝取引起膠質(zhì)細胞激活和增生，激活的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)興奮性增高，最終引發(fā)癲癇發(fā)作，而增生的異常星形膠質(zhì)細胞在維持癲癇復發(fā)中起著重要作用。血腦屏障破壞在外傷性癲癇的發(fā)生、發(fā)展中扮演者重要角色，這對研究人類外傷性癲癇的機制有重要的意義。本實驗因樣本數(shù)量及觀察周期限制有其局限性，這需要進一步去研究，膠質(zhì)細胞激活后究竟釋放何種因子及具體相關機制仍需做更深的探討。

[1]Jensen FE.Introduction posttraumatic epilepsy：Treatable epileptogenesis[J].Epilepsia，2009，50（Suppl 2）：1－6.

[2]Frey LC.Epidemiology of posttraumatic epilepsy：A critical review[J].Epilepsia，2003，44（Suppl 10）：11－17.

[3]Tomkins O，F(xiàn)eintuch A，Benifla M，etal.Blood－brain barrier breakdown following traumatic brain injury：A possible role in posttraumatic epilepsy[J].Cardiovascular Psychiatry and Neurology，2011，2：1－11

[4]吳旭，王保捷，張國華，等.大鼠腦損傷分級自由落體打擊模型的建立[J].中國法醫(yī)學雜志，2005，20（1）：1－3.

[5]Carrera RM，Pacheco AM，Mastroti RA.Qualitative evaluation of the blood－brain barrier after the use of hypertonic saline solution in young rats[J].Eur Surg Res，2001，33（5－6）：311－317.

[6]Pekny M，Nilsson M.Astrocyte activation and reactive gliosis[J].Glia，2005，50（4）：427－434.

[7]Kharatishvili I，Nissinen JP，Mcintosh TK，etal.A model of posttraumatic epilepsy induced by lateral fluid－percussion brain injury in rats[J].Neuroscience，2006，140（2）：685－697.

[8]許尚臣，龐琦.創(chuàng)傷性癲癇動物模型的研究進展[J].中華創(chuàng)傷雜志，2007，23（5）：397－400.

[9]Oby E，Janigro D.The blood－brain barrier and epilepsy[J].Epilesia，2006，47（11）：1761－1774.

[10]vanVliet EA，CostaAraújo S，Sedeker R，etal.Blood－brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy[J].Brain，2007，130：521－534.

[11]Cornford EM，Oldendorf WH.Epilepsy and the blood－brain barrier[J].Adv Neurol，1986，44：787－812.

[12]Marchi N，Angelov L，Masaryk T，etal.Seizure－promoting effect of blood－brain barrier disruption[J].Epilepsia，2007，48（4）：732－742.

[13]Ilbay G，Dalcik C，Yardimoglu M，etal.The blood－brain barrier and epilepsy[J].Epilepsy，2012，2：31－46.

[14]Seiffert E，Dreier JP，Ivens S，etal.Lasting blood－brain barrier disruption induces epileptic focus in the rat somatosensory cortex[J].J Neurosci，2004，24（36）：7829－7836.

[15]Tomkins O，F(xiàn)riedman O，Ivens S，etal.Blood－brain barrier disruption results in delayed functional and structural alterations in the rat neocortex[J].Neurobiol Dis，2007，25（2）：367－377.

[16]Cacheaux LP，Ivens S，David Y，etal.Transcriptome profiling reveals TGF－beta signalling involvement in epileptogenesis[J].J Neurosci，2009，29（28）：8927－8935.

[17]Friedman A，Kaufer D，Heinemann U.Blood－brain barrier breakdown－inducing astrocytic transformation：Novel targets for the prevention of epilepsy[J].Epilepsy Res，2009，85（2－3）：142－149.

[18]Shapiro LA，Wang L，Ribak CE.Rapid astrocyte and microglial activation following pilocarpine－induced seizures in rats[J].Epilepsia，2008，49（Suppl 2）：33－41.

[19]王磊.星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用[J].生物技術通報，2010（6）：33－36.

[20]Vessal M，Dugani CB，Solomon DA，etal.Might astrocytes play a role in maintaining the seizure－prone state？[J].Brain Res，2005，1044（2）：190－196.

[21]Friedman AR，Cacheaux LP，Ivens S，etal.Elucidating the complex interactions between stress and epileptogenic pathways[J].Cardiovasc Psychiatry Neurol，2011，2011：461263.

[22]Haltiner AM，Temkin NR，Dikmen SS.Risk of seizure recurrence after the first late posttraumatic seizure[J].Arch Phys Med Rehabil，1997，78（8）：835－840.