參附注射液對原代培養乳鼠心肌細胞缺氧－復氧損傷的影響

王建剛，田首元

參附注射液（Shen－fu injection，SFI）是臨床上常用的中藥，其主要藥理成分為人參皂苷和烏頭堿，對心肌缺血／再灌注損傷具有保護作用[1，2]，但其作用機制還有待探討。本研究采用原代培養的心肌細胞建立缺氧／復氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）損傷模型模擬體內缺血／再灌注損傷，研究SFI對體外培養的心肌細胞H／R損傷的保護作用，并對其作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 參附注射液（批號：041105，雅安三九藥業有限公司），胎牛血清、低糖DMEM培養基、高糖DMEM培養基（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶（Amresco公司，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus Optical公司，日本），CO2恒溫細胞培養箱（Forma Scientific公司，美國）。5－溴－2－脫氧尿核苷（5－bromo－2－deoxyuridine，BrDU）。DXC800型全自動生化分析儀、Access2型免疫化學發光分析儀（Beckman公司，美國），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。EPICS Elite型流式細胞儀（Beckman coulter公司，美國）。

1.2 原代心肌細胞培養 取出生1d～3dWistar乳鼠，雌雄不限（山西醫科大學動物中心提供），75%酒精浸泡后，無菌條件下取其心臟置于預先盛有D－Hanks液的無菌平皿內，用含抗生素的D－Hanks灌沖洗兩遍。取心室肌剪碎至1mm3～2 mm3大小的組織塊，移入5 0mL離心管中，用適量預溫的0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA 37℃水浴震蕩分次消化，每次約8min，直至組織塊完全消化。收集除第1次以外的單細胞懸液，放入含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，終止消化7目篩網過濾去除未消化的組織，在4℃時以1 000r／min離心10min，棄上清，收集沉淀，加入培養液（80%DMEM、20%胎牛血清、青霉素100U／mL、鏈霉素100U／mL和0.1mmol／L Br－DU）混懸。臺盼藍染色計數，調整細胞數至5×106／L。接種到25mL培養瓶中，置37℃培養箱（含95%空氣＋5%CO2）中培養2h以純化心肌細胞（差速貼壁法）。接種到24孔培養板中，每24h觀察細胞貼壁及生長情況，并更換培養液。其中BrDU在細胞培養36h內加入以抑制非心肌細胞增殖。接種3d～4d后，用無血清的DMEM培養24h，使細胞周期同步化后行缺氧／復氧干預。

1.3 心肌細胞缺氧／復氧損傷模型建立 參照文獻[3]的方法以及具體實驗條件加以改進。上述原代培養的心肌細胞棄上清，換以經95%N2＋5%CO2混合氣體飽和的低糖、無血清DMEM培養液，置于37℃密閉容器內（含95%N2＋5%CO2混合氣體）缺氧1h后，取出更換為以95%空氣＋5%CO2混合氣體飽和的高糖、含10%胎牛血清的DMEM培養液在37℃孵箱（含95%空氣＋5%CO2）中復氧3h。

1.4 實驗分組 將培養的心肌細胞隨機分4組。正常對照組（C組）：37℃孵箱中持續孵育4h，未經缺氧／復氧處理；缺氧／復氧損傷模型組（H／R組）：給予培養的心肌細胞單純缺氧1h，復氧3h。缺氧／復氧＋低劑量SFI組（SFI－L組）：在缺氧前30 min加入終濃度為50μmol／mL的SFI，再缺氧1h／復氧3h；缺氧／復氧＋高劑量SFI組（SFI－H組）：在缺氧前30min加入終濃度為100μmol／mL的SFI，再缺氧1h，復氧3h。

1.5 觀察指標

1.5.1 上清液肌酸激酶同工酶（CK－MB）、心肌肌鈣蛋白I（cTn－I）含量測定 復氧末取細胞上清培養液，置－20℃ 冰箱保存批量待測。分別由Beckman DXC800全自動生化分析儀測定CK－MB含量，化學免疫發光法檢測cTn－I含量。

1.5.2 心肌細胞MDA含量和SOD活性的檢測 用硫代巴比妥法（TBA）測定MDA含量，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.5.3 心肌細胞凋亡率測定 采用流式細胞儀檢測75%胰蛋白酶消化貼壁心肌細胞，消化分離后收集到試管中離心10min（1 000r／min），將細胞懸液用1mL空針抽吸兩遍制成單細胞懸液，懸于70%冷乙醇（4℃）過夜。檢測時離心10 min（1 000r／min），PBS洗去乙醇。細胞沉淀用PI 4℃避光染色30min，上機檢測。G期前的亞二倍體峰即代表凋亡峰，反映凋亡細胞的百分比。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較應用SNK－q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

與C組比較，H／R組心肌細胞培養液CK－MB、cTn－I含量、心肌細胞內MDA含量以及凋亡指數顯著上升，SOD活性顯著下降 （P＜0.01）。與 H／R 組 比 較，SFI－L 組、SFI－H 組 中除SOD活性顯著上升外，上述其他指標均顯著下降（P＜0.01）。SFI－L組和SFI－H組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組CK－MB、cTn－I、MDA含量、SOD活性及凋亡指數比較（±s）

表1 各組CK－MB、cTn－I、MDA含量、SOD活性及凋亡指數比較（±s）

組別 n CK－MB（U／L） cTn－I（ng／mL） MDA（nmol／L） SOD（nU／mL） 凋亡指數（%）C組 10 1.20±0.43 0.012±0.007 6.29±0.91 26.37±2.86 3.11±0.45 H／R組 10 10.38±2.411） 0.901±0.0141） 21.76±2.631） 13.12±3.111） 20.22±3.241）SFI－L組 10 5.25±1.401）2） 0.465±0.0221）2） 15.47±1.631）2） 19.22±2.051）2） 8.66±1.251）2）SFI－H組 10 4.63±1.251）2） 0.431±0.0181）2） 14.10±1.421）2） 21.05±2.331）2） 7.46±1.441）2）與C組比較，1）P＜0.01；與 H／R組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本研究所用SFI為臨床常用針劑型，結合以往研究及預實驗結果，選擇SFI濃度為50μmol／mL和100μmol／mL進行實驗[4，5]。CK－MB和cTn－I正常情況下存在于心肌細胞內，當心肌細胞受損或壞死后就溢出胞外，釋放水平愈高，則代表細胞損傷壞死愈重，是反映心肌損傷的特異性和敏感性均較高的指標[6，7]。本研究結果顯示，H／R組上清液CK－MB、cTn－I含量以及心肌細胞凋亡指數均較C組明顯升高，表明心肌細胞H／R損傷模型制備成功。

從結果可以看出，SFI組上清液CK－MB、cTn－I含量以及心肌細胞凋亡指數均較H／R組顯著下降，表明SFI可通過減少CK－MB和cTn－I的釋放，抑制心肌細胞凋亡，對H／R損傷心肌細胞產生保護作用。心肌細胞H／R損傷發生機制尚未完全闡明，目前認為主要通過黃嘌呤氧化酶途徑產生大量氧自由基聚集，介導膜脂質過氧化反應，使細胞膜流動性和通透性增加，完整性喪失，膜對離子轉運功能障礙，Na＋、K＋、Ca2＋等離子在細胞膜內外分布異常致心肌細胞嚴重腫脹，線粒體功能受損，氧利用率降低。大量Ca2＋涌入細胞導致Ca2＋超載，通過加速黃嘌呤脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶，促使氧自由基增多，進一步加重再灌注損傷[8，9]。MDA是氧自由基致脂質過氧化的中間代謝產物，可反映細胞機體內脂質過氧化程度，間接反映細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度，SOD可清除機體內超氧自由基，保護細胞，因而SOD高低可間接反映機體清除氧自由基的能力[10，11]。本研究結果顯示，H／R可引起心肌細胞 MDA水平明顯上升而SOD活性明顯下降（P＜0.01），SFI則能顯著抑制H／R所致的MDA水平上升和SOD活性下降（P＜0.01），說明SFI是通過減少氧自由基產生，抑制機體內脂質過氧化程度，從而對心肌細胞產生保護作用。本研究中SFI選用了兩組濃度，結果顯示增加SFI濃度后心肌保護作用的增強并不具統計學意義。

綜上所述，SFI能顯著降低原代培養心肌細胞CK－MB、cTn－I含量，抑制心肌細胞凋亡，對心肌H／R損傷產生保護作用，其機制可能與提高心肌細胞SOD活性，減少MDA生成量，減輕脂質過氧化反應有關。

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