胎盤生長(zhǎng)因子在寧心利肺湯干預(yù)肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中的作用

姜紅菊，張 偉，李潤(rùn)智，陳守強(qiáng)，韓有為，王 營(yíng)

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立與分組 30只Wistar雄性大鼠（體重200 g～220g），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選10只為正常組，另外20只按照60mg／kg野百合堿（將野百合堿溶于適量0.5mol／L的HCl中，用0.5mol／L的NaOH，將pH調(diào)整至7.4）項(xiàng)背部皮下注射。再隨機(jī)分為治療組及對(duì)照組，各10只，注射后第3天治療組給予寧心利肺湯灌胃（根據(jù)人每公斤體重劑量的6.25倍給予），每天1次，對(duì)照組給予同等量的生理鹽水灌胃，共6周。

1.2 壓力測(cè)定 動(dòng)物飼養(yǎng)到規(guī)定的天數(shù)后，用戊巴比妥鈉35 mg／kg腹腔注射，麻醉充分后，取仰臥位，鈍性分離右側(cè)頸外靜脈，在上做一橫切口，將微導(dǎo)管（Finecross1.8F）插入，并經(jīng)上腔靜脈、右心房、右心室到肺動(dòng)脈，導(dǎo)管外端通過(guò)壓力換能器接電生理記錄儀，記錄肺動(dòng)脈平均壓（MPAP）、右室收縮壓（RVSP）。

1.3 胎盤生長(zhǎng)因子（PLGF）測(cè)定 壓力測(cè)定完后留取靜脈血0.5mL，離心留取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA檢測(cè)試劑盒）檢測(cè)胎盤生長(zhǎng)因子的含量。

1.4 右心室肥厚指數(shù)測(cè)定 大鼠放血處死，解剖胸腔取出心臟，PBS緩沖液將心臟內(nèi)血液沖洗干凈，沿房室溝剪去心房、主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，沿室間隔邊緣分離出右室，還有左室＋室間隔，用濾紙吸干水分后稱重并計(jì)算右室肥大指數(shù)＝右室／左室＋室間隔。

1.5 肺血管重構(gòu)的觀察 取出心臟后，生理鹽水通過(guò)肺動(dòng)脈沖洗剩余的血液，同時(shí)10%甲醛20cmH2O（1cmH2O＝0.098 kPa）壓力下經(jīng)氣管注入肺中，約5min取出右肺，10%甲醛固定48h，常規(guī)石蠟包埋切片（在右中葉距肺門2mm～3mm處取材），行HE染色，應(yīng)用圖像采集分析系統(tǒng)測(cè)量肺血管直徑＜300 μm管壁的相對(duì)中膜厚度（MT），計(jì)算MT%＝管壁的相對(duì)中膜厚度／外徑。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組各檢測(cè)指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，治療組大鼠死亡2只，對(duì)照組大鼠死亡1只。治療組和對(duì)照組大鼠體重?zé)o明顯差異。治療組大鼠右室收縮壓、肺動(dòng)脈平均壓、胎盤生長(zhǎng)因子、右室肥大指數(shù)、直徑＜300μm肺血管管壁中膜厚度及 MT%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 3組各檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）

表1 3組各檢測(cè)指標(biāo)比較（±s）

組別 n 體重（g） RVSP（mmHg） MPAP（mmHg）右室肥大指數(shù)（%） 管壁厚度（μm） MT（%） PLGF（ng／L）治療組 10 390.75±11.71 38.05±3.312） 27.11±1.382） 30.78±3.712） 32.17±6.642） 17.34±0.732） 3.72±0.712）對(duì)照組 10 378.24±10.751） 65.54±4.231） 38.67±1.851） 48.23±4.661） 47.63±9.891） 23.97±5.911） 5.15±0.371）正常組 10 384.65±12.43 24.73±6.52 14.78±1.93 25.91±0.77 11.68±1.24 6.59±1.63 2.33±0.47與正常組比較，1）P＜0.05；與對(duì)照組比較，2）P＜0.05

2.2 顯微鏡觀察 正常組肺血管管壁較薄、管腔內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)增生現(xiàn)象。對(duì)照組可見(jiàn)肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚、管腔縮小。治療組的變化較對(duì)照組明顯減輕。

3 討 論

肺動(dòng)脈高壓主要原因是肺小動(dòng)脈原發(fā)病變或其他的相關(guān)疾病導(dǎo)致的肺血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞增生，肺血管閉塞，肺動(dòng)脈阻力增加。它可引起右室后負(fù)荷增加、右室肥大、右心衰。目前肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的建立主要有慢性缺氧法、手術(shù)分流法、野百合堿注射法、肺葉切除＋野百合堿注射。本研究采用的是野百合堿注射。

野百合堿是雙吡咯類生物堿，在經(jīng)過(guò)肺血管床時(shí)，損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起平滑肌細(xì)胞增生，使血管屏障受損，誘發(fā)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)，增加縮血管物質(zhì)內(nèi)皮素、血栓素A2等，降低舒血管物質(zhì)6－酮－前列腺素、降鈣素基因相關(guān)肽等，引起血管收縮，導(dǎo)致血管阻力增加、血管重構(gòu)，這中間內(nèi)皮細(xì)胞的損傷起了很重要的作用[1]。有很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)野百合堿可以重復(fù)誘導(dǎo)嚴(yán)重的進(jìn)展型肺動(dòng)脈高壓，本研究也給予了證實(shí)。本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，給予野百合堿注射，成功地誘導(dǎo)了肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，治療組、對(duì)照組注射野百合堿6周后肺動(dòng)脈平均壓顯著高于正常組?？梢?jiàn)野百合堿注射可以建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，以此模型為基礎(chǔ)進(jìn)行的研究將對(duì)肺動(dòng)脈高壓的臨床工作提供有意義的幫助。治療組、對(duì)照組右室收縮壓顯著高于正常組。肺動(dòng)脈壓力升高可使右室后負(fù)荷加重，引起右心室的肥大，治療組、對(duì)照組的右室肥大指數(shù)也顯著高于正常組。Blaudszun等[2]將28只大鼠隨機(jī)分為兩組，一組注射野百合堿60mg／kg，4周后發(fā)現(xiàn)右室肥厚、收縮壓的升高及肺動(dòng)脈高壓。同樣野百合堿成功誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型也見(jiàn)于Zapata－Sudo等[3]的報(bào)道。

本研究中野百合堿注射后大鼠直徑＜300μm肺血管管壁中膜厚度及管壁的相對(duì)中膜厚度占血管外徑的百分比都明顯高于正常大鼠，可見(jiàn)注射了野百合堿后大鼠的肺動(dòng)脈發(fā)生了結(jié)構(gòu)重構(gòu)，出現(xiàn)了肺動(dòng)脈的增生和肥厚。Zhao等[4]對(duì)豬腹腔注射野百合堿10mg／kg4個(gè)月～4.5個(gè)月，4周、8周后觀察到肺動(dòng)脈高壓及其肺動(dòng)脈的管壁中膜厚度的增加。提示野百合堿還可以成功建立豬的肺動(dòng)脈高壓模型。

寧心利肺方由黃芪、麥冬、五味子、川芎、丹參、葶藶子、車前子、冬瓜皮、益母草、澤蘭、木香、生甘草組成。此方中黃芪健脾補(bǔ)虛，麥冬養(yǎng)陰生津，五味子斂陰益氣，3藥相合，使氣復(fù)津生，汗止陰存，氣充脈復(fù)。丹參、川芎活血化瘀使血行暢通，葶藶子、澤瀉、冬瓜皮泄肺利水，車前子、益母草活血利水。水在胸脅用葶藶子，因其素有“治肺經(jīng)陽(yáng)分氣閉”之功能，其“行氣祛瘀，瀉肺利水”效果顯著。補(bǔ)氣之中使用理氣之品木香，使全方補(bǔ)而不滯。炙甘草調(diào)和諸藥，從而達(dá)到氣復(fù)、血行水去，故不治痰而痰自去，不平喘而喘自平。本研究將它運(yùn)用于肺動(dòng)脈高壓大鼠，結(jié)果治療組右室收縮壓、肺動(dòng)脈平均壓、胎盤生長(zhǎng)因子、右室肥大指數(shù)、直徑＜300μm肺血管管壁中膜厚度及MT%較對(duì)照組明顯下降。可見(jiàn)此方對(duì)肺動(dòng)脈高壓的有明顯療效。

胎盤生長(zhǎng)因子屬于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，不僅控制血管生成，也精細(xì)調(diào)整炎癥反應(yīng)。它能夠刺激肺血管平滑肌細(xì)胞核內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，引起血管的新生，加上它的促炎癥作用，引起血管重構(gòu)[5]。本研究證實(shí)肺動(dòng)脈高壓小鼠PLGF是增加的，也證實(shí)了它與肺動(dòng)脈高壓存在相關(guān)性，并且寧心利肺湯治療后明顯下降，說(shuō)明寧心利肺湯可以降低肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈壓可能與對(duì)PLGF的影響有關(guān)。

[1]Tyler RC，Muramatsu M，Abman SH，etal.Variable expression of endothelial NO synthase in three forms of rat pulmary hypertension[J].Am J Physiol，1999，276（2pt 1）：297－303.

[2]Blaudszun GT，Morel DR.Superiority of desflurance over sevoflurance and isoflurane in the presence of pressure－overload right ventricle hapertrophy in rats[J].Anesthesiology，2012，117（5）：1051－1061.

[3]Zapata－Sudo G，Pontes LB，Silva JS，etal.Benzenesulfonamide attenuates onocrotaline－induced pulmonary arterial hypertension in a rat model[J].Eur J Phamacol，2012，690（1－3）：176－182.

[4]Zhao J，Liu R，Li H，etal.Pathological changes of monocrotalineinduced pulmary hypertension in miniature pigs[J].Journal of Southern Medical University，2012，32（6）：867－869.

[5]Tuder RM，Cool CD，Yeager M，etal.The pathobiology of pulmo nary hypertension endothetium[J].Clin Chest Med，2001，22：405－418.