倒卵葉五加及其復方佳蓉片對大鼠的抗衰老作用

楊 倩 謝艷華周暄宣 朱愛華 同卓斌 胡少婷 王四旺

1.第四軍醫大學藥學院天然藥物學教研室，陜西西安， 710032；2.陜西醫藥控股集團公司陜西中藥研究所，陜西西安 710082

衰老是正常的生理現象，亦是自然規律。抗衰老一直是醫學界普遍關注的科學問題，但因衰老機制不明，防治衰老的藥物實無根本突破。英國學者Hatman 曾于1956年提出衰老的自由基學說，認為人體內存在清除自由基的防御系統，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物（GSH-Px）及維生素、氨基酸、金屬蛋白等；隨著年齡的增長，機體抗氧化防御物質合成和活性下降，清除自由基能力降低，導致自由基代謝產物丙二醛（MDA）等大量堆積，加速機體的衰老[1-2]。中醫認為，衰老與腎虛、腎精不足密切相關，補腎中藥是中藥延緩衰老的有效藥物。佳蓉片是我科室20 世紀90年代研制成功的主治更年期綜合征新藥（國藥證字Z20026690），經多年臨床應用證實，不僅對更年期綜合征具有明顯療效，而且發現能夠顯著改善衰老證侯，如減少面部皺紋、延緩絕經期、促進生育能力[3-5]。為什么佳蓉片會有如此功效呢？經檢索和分析處方中倒卵葉五加可能具有抗衰老作用。為證實該推論，本研究設計了倒卵葉五加的抗衰老作用實驗研究，以期探討倒卵葉五加和佳蓉片對亞急性衰老大鼠血清MDA 含量，GSH-Px 和SOD活性、總抗氧化能力（T-AOC）、以及睪丸組織中NO、iNOS含量的影響；評價倒卵葉五加及其復方的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

D-半乳糖，批號201112B09，北京化學試劑公司，采用生理鹽水配成 6%的溶 液；SOD、MDA、GSH-P、T-AOC、NO、iNOS 試劑盒，南京建成生物工程研究所。倒卵葉五加浸膏，含生藥量3.8 g/g 浸膏，批號2011091201，由寶雞飲片出品；佳蓉片，批號201111032，陜西博愛制藥有限公司出品。

1.2 實驗動物

SD 大鼠，8周齡，雄性 60只，體重 200～250 g[由第四軍醫大學實驗動物研究中心提供，動物合格證號：SCXK（軍）字第2007-007 號]。隨機分為正常組、模型組、倒卵葉五加組、佳蓉片組、維生素E 組，每組12只大鼠。D-半乳糖連續腹腔注射（320 mg/kg，50 d）建立亞急性衰老大鼠模型，各組大鼠在腹腔注射D-半乳糖 （正常組動物注射等量生理鹽水）的同時，正常和模型組大鼠灌胃生理鹽水（10 ml/kg）、其他各組依次給予倒卵葉五加（1 g/kg）、佳蓉片（6 g/kg）、維生素 E（20 mg/kg），用藥 50 d。

1.3 抗氧化指標檢測

大鼠末次給藥后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，內眥取血2 mL，離心取上清；按照TBA 法檢測MDA 含量，比色法檢測GSH-Px，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，鐵還原法檢測T-AOC 等指標。

1.4 NO、iNOS 含量

大鼠斷頭處死，每只大鼠取左側睪丸組織約100 mg 濾紙吸干水分后稱重，冰浴條件下切成小米粒大小組織塊，加入適量冷生理鹽水，制成10%組織勻漿，4 000 r/min離心12 min，取勻漿上清，以冷生理鹽水稀釋成需要濃度，酶標儀測定組織蛋白含量，按照試劑盒說明進行操作，測定睪丸組織N0、iNOS的含量。

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗，計數資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 為差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 抗氧化能力的影響

模型組大鼠MDA 含量明顯升高，GSH-Px、SOD 活性T-AOC 明顯降低，與正常組比較差異具有統計學意義（P＜0.01 或P＜0.05）。倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 明顯抑制衰老大鼠MDA 含量升高；顯著升高GSH-Px、SOD、T-AOC活性，各試藥組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。 見表1。

表1 大鼠各指標檢測結果（±s，n=12）

表1 大鼠各指標檢測結果（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05

組別 MDA（nmol/mL）GSH-Px（U/mL）SOD（U/mL）T-AOC（U/mL）正常組模型組倒卵葉五加組佳蓉片組維生素E 組2.35±0.75*5.12±0.94 2.51±0.70*2.45±0.69*2.41±0.64*19125±430**1410±259 4148±398**4208±3021**5023±289**201±22**147±19 198±18*189±19*210±23**201±22**147±19 198±18*189±19*210±23**

2.2 睪丸組織NO 和iNOS的含量

模型大鼠睪丸組織NO 和iNOS的含量明顯升高，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 顯著降低睪丸組織NO 和iNOS含量，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠睪丸組織NO和iNOS的含量（±s，n=12）

表2 各組大鼠睪丸組織NO和iNOS的含量（±s，n=12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 體重（g） NO[U/（mg ·prot）] iNOS[U/（mg ·prot）]正常組模型組倒卵葉五加組佳蓉片組維生素E 組280.3±23.00 268.8±21 277.3±24 279.5±22 280.5±30 2.44±0.15**5.40±0.352.38±0.42**2.43±0.19**2.45±0.20**29.88±1.35*51.40±1.89 33.49±1.55*34.21±1.66*32.38±1.65*

3 討論

劉國強等[6]報道，MDA的含量可代表脂質過氧化產物的濃度，間接反映組織的損傷程度。所以，MDA是機體衰老過程中產生的過量超氧陰離子自由基與脂質發生過氧化反應的終產物[7]。GSH-Px是機體廣泛存在的重要的過氧化物分解酶，其功能是催化谷胱甘肽（GSH）參與過氧化反應，清除細胞在呼吸代謝過程中產生的過氧化物和羥自由基，從而減輕不飽和脂肪酸的過氧化作用。Giardino 等[8]早在2002年就證實，隨著年齡增加機體氧化還原平衡逐漸被打破，過氧化產物不斷積累、抗氧化物質的含量明顯下降，導致衰老。正常情況下，SOD的功能是清除體內新陳代謝過程中產生的自由基，使機體氧化與抗氧化保持平衡[9]；T-AOC 反映體內酶性和非酶性抗氧化物的總水平，血清T-AOC 含量是全面評估機體抗氧化能力的重要指標。

倒卵葉五加是佳蓉片中的君藥。倒卵葉五加具有健脾益氣、補腎寧心、舒筋活絡的功能，適用于體虛乏力、食欲不振、腰膝酸軟、陽痿、失眠多夢、健忘、風寒濕痹等。本研究證實，D-半乳糖致模型大鼠血清MDA 含量明顯升高，SOD、GSH-Px 活性、T-AOC 明顯下降， 說明模型大鼠抗氧化能力明顯降低；倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 能明顯降低D-半乳糖誘發的衰老大鼠血清MDA 含量，升高SOD、GSH-Px、T-AOC 含量；這不僅說明倒卵葉五加具有顯著抗氧化應激能力并發揮抗衰老作用，同時也提示佳蓉片臨床應用表現出的具有一定延緩衰老的功效應該與其君藥地位密切相關。

細胞的能量代謝障礙及凋亡是多種器官衰老退化的重要基礎，NO 能直接調控氧與血紅素的結合與釋放，進而控制對線粒體的氧供給，導致細胞內[10]水平下降，引起細胞凋亡[11]；睪丸組織是雄性生物生殖能力的重要器官，由此中醫稱“腎乃先天之本，生命之源”。本試驗發現，D-半乳糖致衰老大鼠睪丸組織NO、iNOS的含量均明顯增高，與文獻報道[12]一致；采用倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E 干預，能明顯降低衰老大鼠睪丸組織NO 和iNOS的含量，說明倒卵葉五加等可通過調節睪丸組織NO、iNOS的含量抑制細胞凋亡，從而延緩睪丸組織的衰老。但是，倒卵葉五加是佳蓉片的君藥，臨床主適應證是用于婦女更年期綜合征，那么，對雌性生殖器官的作用如何，本課題組的研究尚在進行中。

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