復方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒的初步實驗研究

譚本仁 徐曉梅 羅 君 郭基燕 許衛關

1.汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院，廣東韶關 512026；2.廣東省韶關市食品藥品檢驗所，廣東韶關 512028

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染會導致急慢性乙型肝炎的發生，是引起肝硬化、肝細胞癌的重要因素之一，每年約有50 萬人死于由HBV 感染引起的急性肝炎、肝硬化及肝癌等疾病[1-2]，目前臨床尚無治療乙肝的特效藥物。復方葉下珠滴丸是由葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草、茵陳、丹參、柴胡等十六味草藥經科學提取工藝精制而成的滴丸，具有疏肝解郁，益氣健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能、調節免疫機能等功效，能防治急慢性肝炎、重癥肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。本實驗采用酶聯免疫吸附檢測（ELISA）技術和熒光定量（PCR）方法，分析復方葉下珠滴丸對HepG2.2.15 細胞培養液及HBsAg 陽性人血清培養液中HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 含量的影響， 觀察復方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒的作用。

1 儀器與材料

1.1 試藥與試劑

試藥：采用復方葉下珠滴丸處方中十六味草藥以水提醇沉法（加水十倍，煎煮1 h，醇沉濃度為60%）制成的流浸膏（每1 mL 含原生藥材1 g）為試藥。

試劑：HBsAg、HBeAg 診斷試劑盒 （新波生物技術公司）， 靶細胞選擇HepG2.2.15 細胞 （HBV 全基因傳染的HepG2 細胞），HBV DNA 熒光定量PCR 試劑盒（上海復興生物技術公司）。

1.2 儀器

EFFICUTA2710 免疫分析儀和全自動樣本前處理系統，Roche Light Cycler480Ⅱ實時熒光定量PCR 系統，37℃5%CO2培養箱（Phermo）。

1.3 統計學方法

采用SPSS v19.0統計軟件進行處理，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，比較采用t 檢驗，計數資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 方法與結果

2.1 細胞培養

將HepG2.2.15 細胞按1 ×105/mL 濃度加入2個24 孔培養板中，放入37℃5%CO2培養箱培養4 d 后換液，將試藥稀釋，分八組不同濃度藥液各滴入4個孔，空白對照組以生理鹽水滴入，亦4個孔，加藥培養于72 h 后各收取1孔細胞上清液，用 ELISA 測定 HBsAg、HBeAg 和PCR 檢測其HBV DNA 含量，并將每組數據與空白對照組進行配對T 檢驗，結果見表1。

根據以上實驗，確定復方葉下珠滴丸試藥最佳抑制效果濃度為120mg/mL。為考察其最佳抑制時間，再以120mg/mL濃度的復方葉下珠滴丸試藥，按以上方法培養，加藥培養后于 24、48、72、96 h 后收取 1 孔細胞上清液再檢測其HBsAg、HBeAg 和 HBV-DNA，48、72、96 h 組間數據分別與24 h 組進行統計學分析，結果見表2。

表1 不同濃度的復方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結果比較（±s）

表1 不同濃度的復方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結果比較（±s）

注：與空白對照比較，*P<0.01

復方葉下珠滴丸濃度（mg/mL）HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）20 40 60 80 100 120 140 160空白對照1.851±0.047*1.740±0.110*0.956±0.017*0.742±0.014*0.562±0.012*0.543±0.005*0.521±0.015*0.552±0.014*2.657±0.257 5.245±0.155*5.234±0.139*5.190±0.138*5.123±0.129*5.101±0.135*4.722±0.144*4.025±0.167*5.081±0.138*6.359±0.106 549 500±17 517 502 300±17 658*464 500±15525*412 700±15697*293 200±21 740*98 700±2 804*121 000±12 152*109 000±13 321*554 300±19 794

表2 不同時間的復方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結果比較（±s）

表2 不同時間的復方葉下珠滴丸體外抗乙肝病毒活性結果比較（±s）

注：與24 h 組比較，*P<0.01

項目 24 h 48 h 72 h 96 h HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）1.812±0.0800.641±0.012*0.533±0.022*0.535±0.024*5.321±0.2185.065±0.1444.101±0.135*4.067±0.140*546300±18621312 500±16 800*75700±987*43 500±1 848*

2.2 血清培養

將復方葉下珠滴丸試藥稀釋為120 mg/mL 溶液分5 組加入HBsAg 陽性人血清（HBsAg 為2.634 ng/mL，HBeAg 為4.799 PEIU/mL，HBV-DNA 為 650 300 IU/mL）， 對照組則加入生理鹽水，于37℃孵育72 h，取上清液分別用ELISA測定各組HBsAg、HBeAg 和 PCR 測定各組HBV-DNA，并作統計學分析，結果見表3。

表3 復方葉下珠滴丸對抗人體血清結果比較（±s）

表3 復方葉下珠滴丸對抗人體血清結果比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.01

組別 HBsAg 含量（ng/mL）HBeAg 含量（PEIU/mL）HBV-DNA 含量（IU/mL）試藥組（120 mg/mL，n=5）對照組（n=5）0.992±0.066*2.253±0.151 3.561±0.163*4.885±0.106 102 500±7 069*651 200±21 998

3 討論

復方葉下珠滴丸是以葉下珠為主藥經科學提取工藝精制而成的滴丸，葉下珠為大戟科植物，有清熱利尿、平肝明目、消積解毒、止瀉之功效，含鞣質類、黃酮類、香豆素類等多種活性成分[3]，對肝損害具有保護作用，能預防原發性肝癌發生[4]，具有抗肝纖維化、抗乙型肝炎病毒的作用[5]，并對肝癌、胃癌多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6-7]。輔藥中半邊蓮對肝癌也有明顯的抑制作用[8]，半枝蓮則可提高機體的抗氧化能力，對肝損傷有保護作用[9]，雞骨草也有顯著的抗乙肝病毒作用[10]。

在HepG2.2.15 細胞培養實驗中，隨著復方葉下珠滴丸試藥濃度的增加，對乙肝病毒的抑制作用逐漸增強，呈現一定的劑量依賴性，但其試液濃度為140 mg/mL 時對HB-sAg、HBeAg 抑制作用最強，而其對HBV DNA的抑制作用最強濃度則為120 mg/mL；而其最佳抑制時間的培養試驗中，72 h 組與96 h 組中的HBsAg、HBeAg 濃度降低并無差異，HBV DNA 抑制作用卻與時間呈一定的依賴性；在血清學培養實驗結果顯示，復方葉下珠滴丸能顯著降低HBsAg濃度，具有明顯抗HBV的作用。實驗結果表明，復方葉下珠滴丸具有明顯的抗乙肝病毒作用，今后筆者將做進一步的藥效學研究，為臨床使用提供實驗依據。

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