線粒體DNA3 1 6 0～3 7 55區(qū)域基因突變與2型糖尿病的關(guān)系

鄭壽煥 楊秀麗 姚慶春 李 蘭 車(chē)惠英 王敬銜

1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林延吉 133000；2.吉林油田總醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林松原 138000

糖尿病是一種遺傳和環(huán)境多種因素綜合作用的疾病，近年來(lái)研究提示，部分糖尿病的發(fā)生與線粒體基因突變有一定的關(guān)聯(lián)[1-2]。WHO將線粒體基因突變型糖尿病歸認(rèn)為特殊類(lèi)型的糖尿病。由于不同種族、不同地區(qū)的2 型糖尿病（T2DM）患者中線粒體基因的突變率不同，線粒體基因突變與糖尿病關(guān)系的報(bào)道不一。本研究對(duì)延邊地區(qū)328例T2DM 患者（其中2例合并耳聾）及108例正常對(duì)照組線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域基因進(jìn)行突變分析，旨在探討延邊地區(qū)T2DM 患者中線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域基因突變情況及了解該地區(qū)該區(qū)域線粒體基因突變與T2DM的關(guān)系，進(jìn)而從中篩選出線粒體基因突變型糖尿病。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2009年12月～2012年2月在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者108例，其中，男65例，女43例，平均年齡（30.4±9.7）歲，作為正常對(duì)照組，臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查均正常，排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾病，近3個(gè)月無(wú)服用任何藥物史；選取同時(shí)期在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的T2DM 患者328例作為2 型糖尿病組，其中，男194例，女134例，平均年齡（35.1±6.9）歲。糖尿病診斷依據(jù)1999年WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除妊娠、急性感染、腫瘤、外傷、心、肝疾病及服用羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、噻唑烷二酮類(lèi)藥物者。所有受檢對(duì)象均為延邊地區(qū)無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體，均簽署知情同意書(shū)。兩組一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究均在醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)情況下進(jìn)行研究。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用Promega公司生產(chǎn)的Wizard@Genomic DNA Purification Kit 提取DNA。取被受檢者肘靜脈血2 mL 到加有EDTA 抗凝劑的真空采血管中，并立刻顛倒混勻，置于離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min，取300 μL 白細(xì)胞加入到1.5mL離心管中，按照細(xì)胞裂解、核裂解、RNA 去除、沉淀蛋白質(zhì)、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的過(guò)程分別加入試劑，進(jìn)行DNA的提取。所得DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，并置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增mtDNA 3160～3755 區(qū)域基因片段 根據(jù)GenBank 中的序列參考文獻(xiàn)報(bào)道[2]，采用長(zhǎng)春百奧生物技術(shù)有限公司合成上游引物：5'-AGCGCCTTCCCCGGTAAATGA-3'， 下游引物：5'-AGAATGATGGCTAGGGTGACTTC-3'。 PCR 擴(kuò)增體系 （50 μL）包括：5 ×Green GO Taq Buffer 10 μL，MgCl22 μL，dNTP 1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.25μL， 滅菌注射用水29.75μL，DNA 5μL；PCR 循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 45s，56℃退火 35s，72℃延伸 45s， 循環(huán) 35次，最后72℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的限制性酶切 20 μL 酶切體系包括：PCR產(chǎn)物 5μL，HaeⅢ內(nèi)切酶 0.5μL， 滅菌注射用水 14.5μL，置于37℃水浴箱中水浴4 h。5%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序 PCR 產(chǎn)物用凝膠電泳DNA回收試劑盒純化回收DNA 片段后，送北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司，完成PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)情況

線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為596 bp，見(jiàn)圖1。限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ酶切位點(diǎn)為GG↓CC， 無(wú)突變者在位點(diǎn)3316、3413、3428 和3608 處存在酶切識(shí)別點(diǎn)， 得到的片段長(zhǎng)度為180、159、147、97 和15bp 5個(gè)片段， 如果位點(diǎn) 3243、3316、3394、3593、3714 發(fā)生突變，則產(chǎn)物片段的數(shù)量和長(zhǎng)度均會(huì)改變。根據(jù)限制內(nèi)切酶HaeⅢ酶切片段情況得到兩種圖譜，見(jiàn)圖2～3，其中，圖2 為線粒體基因3316 位點(diǎn)發(fā)生突變，圖3 為線粒體基因3394 位點(diǎn)發(fā)生突變。

2.2 直接測(cè)序法檢測(cè)情況

直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)線粒體基因3316 位點(diǎn)發(fā)生G→A 變異，3394 位點(diǎn)發(fā)生T→C 變異。見(jiàn)圖4～5（見(jiàn)封三）。

2.3 線粒體DNA 3160～3755 區(qū)域各位點(diǎn)突變情況

在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變12例，突變率為3.7%，在108例正常對(duì)照組中檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變4例，突變率為3.8%（P＞0.05）；在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA3394 T→C 突變24例，突變率為7.3%，在108例正常對(duì)照組中檢出線粒體DNA 3394 T→C 突變2例，突變率為1.8%（P＜0.05）；在328例T2DM 患者中及108例正常對(duì)照組中均未檢測(cè)到線粒體 DNA3243 A→G、3593T→C 和 3714 A→G突變。

3 討論

線粒體基因突變糖尿病被WHO公認(rèn)為一種特殊類(lèi)型的糖尿病，目前根據(jù)發(fā)病特點(diǎn)和一般的常規(guī)檢查很難確診，臨床上一般按照T2DM 進(jìn)行診療。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在了解延邊地區(qū)線粒體基因3160～3755 區(qū)域基因突變情況，進(jìn)而從中篩選出線粒體基因突變型糖尿病，采取針對(duì)性的個(gè)性化治療。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力工廠，它主要通過(guò)氧化磷酸化功能為生物組織和細(xì)胞提供能量和ATP 進(jìn)行生命活動(dòng)。線粒體DNA是具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯功能的環(huán)狀雙鏈DNA分子。線粒體DNA 3316 和3394 突變均位于呼吸鏈復(fù)合物NADH 脫氫酶第1 亞單位（ND1）基因的高度保守區(qū)，線粒體DNA3316 G→A 突變使丙氨酸被蘇氨酸替換，3394 T→C 點(diǎn)突變使酪氨酸變成組氨酸，上述兩位點(diǎn)突變均改變了NADH 脫氫酶（復(fù)合體）亞單位1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ酶活性，影響線粒體氧化磷酸化的能力，ATP 生成減少，降低胰島細(xì)胞分泌胰島素的能力，使胰島素作用缺陷，從而誘發(fā)糖尿病[1]。關(guān)于不同地域不同種族中該位點(diǎn)突變與糖尿病關(guān)系的報(bào)道結(jié)論不一致。

國(guó)外學(xué)者研究認(rèn)為，在糖尿病人群中3316 G→A 突變率為3.4%，而在正常人群中檢出3316 突變率為1.0%，且兩組檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。Nakagawa 等[4]認(rèn)為線粒體DNA 3316 G→A 突變是T2DM的致病性基因突變。Deng等[5]研究結(jié)果顯示，線粒體DNA 3316 G→A 突變不是糖尿病發(fā)病的主要易感基因，可能只引起T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)性增高，間接地說(shuō)明線粒體DNA 3316 G→A 突變?cè)谔悄虿〉陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中不起主要作用。也有研究報(bào)道該基因突變僅為人群中的基因多態(tài)性，與T2DM的發(fā)生無(wú)關(guān)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變12例，突變率為3.7%；在108例正常對(duì)照組中檢出線粒體DNA 3316 G→A 突變4例，突變率為3.8%（P＞0.05），提示線粒體 DNA 3316 G→A 突變與延邊地區(qū)T2DM的發(fā)生可能無(wú)關(guān)，考慮可能與線粒體基因的閾值效應(yīng)特性有關(guān)。

日本研究證實(shí)，線粒體DNA 3394 T→C 在糖尿病中的突變率為4.9%，在正常人群中為1.3%，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示線粒體DNA 3394 T→C 與糖尿病的發(fā)生有一定的相關(guān)性[8]。國(guó)內(nèi)報(bào)道在T2DM 人群中3394 T→C 突變率為3.0%～6.0%，正常人群為0～2.06%[9]。本課題在328例T2DM 患者中共檢出線粒體DNA 3394 T→C 突變24例，其突變率為7.3%；在108例正常對(duì)照組中檢出線粒體DNA 3394 T→C 突變2例，其突變率為1.9%（P＜0.05）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后認(rèn)為，線粒體DNA 3394 T→C 變異與延邊地區(qū)T2DM 有一定的相關(guān)性。筆者認(rèn)為線粒體DNA 3394 T→C 突變可能屬于線粒體突變糖尿病。

早在1992年有學(xué)者報(bào)道了一個(gè)母系遺傳的伴有耳聾的糖尿病家系，證實(shí)該家系中存在線粒體DNA tRNA leu（UUR）3243 A→G的突變[10]。而中國(guó)云南的225例糖尿病人群中未檢出該位點(diǎn)的突變[7]。本研究在糖尿病合并耳聾的2例患者中未發(fā)現(xiàn)3243 位點(diǎn)的突變，在2 型糖尿病組及正常對(duì)照組均未檢測(cè)到3593、3714 位點(diǎn)的突變，考慮可能上述位點(diǎn)的突變率極低，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步的研究。

綜上所述，筆者認(rèn)為線粒體DNA 3316 G→A 突變與延邊地區(qū)T2DM的發(fā)生無(wú)關(guān)；線粒體DNA 3394 T→C 突變與延邊地區(qū)T2DM的發(fā)生有關(guān)；線粒體DNA 3423 A→G，3593 T→C，3714 A→G 突變?cè)谘舆叺貐^(qū)T2DM 中的突變率為0，提示上述位點(diǎn)基因突變率極低。

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