異檸檬酸脫氫酶1基因多態性對非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響

王 艷 Amit K Mitra Jatinder K Lamba 姬懷雪

1.徐州醫學院附屬醫院藥劑科，江蘇徐州 221006；2.美國明尼蘇達大學藥學院，美國明尼蘇達 55108

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一組高度異質性的惡性血液腫瘤。阿糖胞苷是治療AML最重要的一線化療藥物，能提高患者生存率[1-2]。然而，阿糖胞苷耐藥的產生一直是影響AML患者生存率的瓶頸[2]。因此，鑒定影響阿糖胞苷耐藥性的關鍵基因的變異，對于避免阿糖胞苷耐藥性的發生有重要作用。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）是近期發現的一種NADP依賴型的異檸檬酸脫氫酶[3]。研究發現，IDH1基因突變致與急性白血病的發生與不良預后密切相關[4]。然而，IDH1對非洲人群急性白血病患者阿糖胞苷耐藥性的影響目前并不清楚。本研究旨在探討IDH1對非洲人群AML患者阿糖胞苷耐藥性的影響，為提高該人群AML患者阿糖胞苷的療效，降低不良反應奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞培養

應用來自國際人類基因組計劃60個非洲人（YRI）EBV病毒轉化的淋巴母細胞系（lymphoblastoid cell line，LCL）。上述細胞株購自美國Coriell醫學研究所。將上述細胞株置于含有L-谷氨酰胺（Lonza Walkersville，Inc.，Walkersville，MD）的 RPMI 1640 培養基中，加15%熱滅活血清37℃，5%CO2條件下培養[5]。

1.2 阿糖胞苷的細胞耐藥性檢測

阿糖胞苷耐藥性檢測參照文獻[6]方法進行。予不同濃度的阿糖胞苷（1，5，40，80 μmol/L）加入細胞中共培養72 h后，應用alamar Blue試劑盒（Biosource international，Camarillo，CA）參照制造商說明書檢測細胞存活曲線、細胞增殖和細胞毒性。梯形法計算阿糖胞苷曲線下面積（AUC）判斷該藥的耐藥性（以更高的AUC表示），AUC進行Log2轉換后統計分析[6]。

1.3 IDH1基因多態性檢測

DNA樣本來自HapMap非洲人群的LCL細胞株。參照文獻[7]，針對IDH1突變熱點區域設計引物，由明尼蘇達大學生物醫學基因組學中心合成。引物序列如下：

正向：5'CTCAGAGCCTTCGCTTTCTG3'；

反向：5'TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT3'。 Taqman PCR反應條件：95℃預變性7 min；然后95℃變性30 s，60℃退火 35 s，72℃延伸 40 s，35 個循環后，70℃延伸10 min，反應產物4℃保存。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳后出現目的條帶樣本由明尼蘇達大學生物醫學基因組學中心直接測序。測序結果在美國國家生物技術信息中心（NCBI）中序列比對（BLAST）比較。

1.4 統計學方法

采用統計軟件R軟件對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用 t檢驗。連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）與單倍型分析、單倍型人群頻率估算采用Haploview 4.2分析。IDH1 SNPs的基因型、最小等位等位基因與阿糖胞苷AUC的分析采用Kruskal-Wallis檢驗及Wilcox檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究發現，非洲人群樣本中，IDH1 rs10173938、rs10192397與阿糖胞苷更高的AUC相關（提示耐藥）。其中，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統計學意義 [rs10173938：AA 比（AC+CC），P=0.040]。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC，二者相比差異有統計學意義[（rs10192397：（CC+CT）比 TT，P=0.036]。 見表 1。

3 討論

本研究首次發現，IDH1 的 SNPs（rs10173938、rs10192397）變異與非洲人群AML患者的阿糖胞苷耐藥性有關。IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于rs10173938的AC及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，IDH1 rs10173938純合子AA基因型攜帶者對阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10173938的最小等位基因A可能是該部分人群對阿糖胞苷耐藥的風險因子。IDH1 rs10192397純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC明顯高于與CT及CC基因型攜帶者阿糖胞苷的AUC（P<0.05）。提示，純合子TT基因型攜帶者阿糖胞苷耐藥可能性大，IDH1 rs10192397的最小等位基因T可能是該部分人群對阿糖胞苷耐藥的風險因子。具體的功能及意義在進一步研究中。

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態性對阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

表1 非洲人群IDH1單核苷酸多態性對阿糖胞苷AUC的影響（±s，n=60）

注：P1為 AA 比（AC+CC）；P2為（CC+CT）比 TT

rs10173938 rs10192397內顯子內顯子AA（n=16）AC（n=32）CC（n=9）CC（n=13）CT（n=34）TT（n=13）3295.371±658.214 2833.301±497.002 3195.382±776.748 2857.324±540.578 2780.298±630.892 3285.368±585.815 P1=0.040 P2=0.036 rs編號 定位 基因型 阿糖胞苷曲線下面積 P值

IDH1基因突變是急性白血病的發生及不良預后的重要因素。IDH1密碼子132R的突變能誘發細胞因子自主性，阻礙造血干細胞分化，誘導AML發生[7-8]。近期文獻發現，攜帶有IDH1密碼子132R和IDH2密碼子R172突變基因的正常核型急性髓細胞白血病（CN-AML）患者或同時伴有IDH及NPM1變異的老年CN-AML患者應用阿糖胞苷化療后易發生阿糖胞苷耐藥，完全緩解率降低[9-10]。本研究發現，IDH1的SNPs（rs10173938、rs10192397）與非洲人群樣本中阿糖胞苷的耐藥性有關。進一步證明，IDH1基因突變是導致AML患者不同的預后及阿糖胞苷耐藥發生的重要因素。具體功能及機制需要大樣本研究進行證實。

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