平喘巴布劑藥材的提取工藝研究

蘭小群 葉秀波 黃雨威 王利勝

1.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510663；2.廣東省廣州市海珠區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510220；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006

平喘巴布劑源于《張氏醫(yī)通》，是由芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛等幾味藥材組成，具有利氣祛痰散寒逐飲之效，多用于穴位敷貼防治哮喘，屬于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，療效確切，且在臨床上具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)[1-2]。在經(jīng)皮給藥制劑中，確保足夠量的藥物透過皮膚進(jìn)入體內(nèi)達(dá)到有效的血藥濃度是關(guān)鍵，方中芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛的主要活性成分均適合于乙醇提取[3-6]，而芥子又為方中君藥，主要含季銨鹽生物堿芥子堿類成分，廣泛存在于十字花科植物中，代表性分是芥子堿，多以硫氰酸鹽形式存在，芥子堿硫氰酸鹽（Sinapine thiocyanate，ST）具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗衰老、抗雄激素、降血壓等多種生物活性[3-7]。因此本研究采用正交試驗(yàn)法，以芥子堿硫氰酸鹽的提取率為指標(biāo)，優(yōu)選藥材乙醇提取工藝，確定最佳提取條件，為平喘巴布劑體內(nèi)外透皮吸收特性的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111702-201002）；芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛等（廣州致信中藥飲片有限公司）；磷酸二氫鉀、乙醇為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為怡寶水。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海青浦滬西儀器廠）；KQ-500型超聲清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；AUW120D精密分析天平（日本島津公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：迪馬 Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），以Phenomenex為保護(hù)柱；流動(dòng)相：乙腈-0.1 mol/L 的磷酸二氫鉀=14∶86；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。 理論塔板數(shù)按芥子堿硫氰酸鹽峰計(jì)算不低于3000。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品5.67 mg，于100 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相溶解制成56.7 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2.2 對(duì)照藥材溶液的制備 精密稱取芥子對(duì)照藥材細(xì)粉1.12 g，置具塞的錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲（功率 250 W，頻率 20 KHz）提取 3次，每次20 min，濾過，濾液減壓回收溶劑至干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，定容，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取芥子、延胡索、細(xì)辛和甘遂，9份，分別按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次提取后趁熱過濾，藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至藥材量1∶1的濃縮液，放至室溫后，加水定量至20 mL。然后精密吸取1～9號(hào)提取液各0.2 mL，置10 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得1～9號(hào)正交試驗(yàn)的供試品溶液。

2.1.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取除芥子外的其他藥材，與供試品溶液同法制備。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 線性范圍考察 分別精密吸取上述芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液 2、6、10、15、20 μL 進(jìn)樣， 測(cè)定，以芥子堿硫氰酸鹽峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=3×106X-29 592，r=0.9999。 結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽進(jìn)樣量在0.1134～1.1340 μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，按芥子堿硫氰酸鹽的峰面積積分值計(jì)算RSD為0.58%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取正交試驗(yàn)5號(hào)供試品溶液 10 μL，分別于 0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定芥子堿硫氰酸鹽峰面積，計(jì)算其RSD為1.08%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取正交試驗(yàn)5號(hào)濃縮液，加水定容至 20 mL，再精密吸取 0.2 mL，5 份，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制備樣品，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽含量平均值為0.536%，RSD為1.06%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取正交試驗(yàn)3號(hào)提取液0.2 mL，6份，分別加入芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液0.1、0.2和 0.4 mL，置 10 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液為加樣回收供試液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率分別為 99.35%（RSD=2.73%），101.66%（RSD=2.13%），99.76%（RSD=1.86%）。 結(jié)果表明，該分析方法的回收率符合要求。

2.1.4 樣品分析

分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的芥子對(duì)照藥材溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下，進(jìn)樣，分別平行測(cè)定兩份，將平均芥子堿硫氰酸鹽峰面積積分值代入線性方程，求各樣品芥子堿硫氰酸鹽的含量，計(jì)算芥子對(duì)照藥材、1～9號(hào)正交試驗(yàn)樣品中芥子堿硫氰酸鹽提取率。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)各藥材的性質(zhì)，選用乙醇為提取溶媒，對(duì)該處方有效成分提取率有較大影響的四個(gè)因素：提取時(shí)間（A）、乙醇用量（B）、乙醇濃度（C）、提取次數(shù)（D），分別擬定3個(gè)水平，以芥子堿硫氰酸鹽提取率（mg/g）為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行優(yōu)選，因素水平表見表1。

表1 因素與水平表

2.3 結(jié)果

2.3.1 各溶液色譜圖

芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品、正交實(shí)驗(yàn)樣品、對(duì)照藥材以及陰性對(duì)照溶液的高效液相色譜圖見圖1。由圖1可見對(duì)照品、樣品及對(duì)照藥材中芥子堿硫氰酸鹽的出峰時(shí)間基本一致，且峰形良好，無雜峰干擾，陰性對(duì)照溶液無干擾，表明所建立的方法具有較好的專屬性，可用于平喘巴布劑提取工藝中芥子堿硫氰酸鹽含量的測(cè)定。

2.3.2 芥子藥材的含量測(cè)定

取本實(shí)驗(yàn)用藥材1.12 g，3份，按照“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照藥材溶液制備方法，制備樣品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽的含量，換算成芥子中芥子堿硫氰酸鹽的含量為0.73%，略高于《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，所以本批藥材符合規(guī)定。

圖1 芥子堿硫氰酸鹽的高效液相色譜圖

2.3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

由表2可知，極差分析各因素對(duì)藥材提取率的影響順序?yàn)椋篊＞A＞D＞B，經(jīng)方差分析只有C因素有顯著性影響，故應(yīng)取最好值C2，A因素雖無顯著性，但影響僅次于C因素，也可取最好值A(chǔ)2，D和B根據(jù)極差，可取有利于生產(chǎn)節(jié)約成本的次好水平B1D2，因此最佳工藝為A2B1C2D2，即6倍量70%的乙醇回流提取2次每次2 h。

2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證

為了考察上述優(yōu)選出的提取工藝的穩(wěn)定性，稱取處方量各藥材，3份，分別以6倍量70%的乙醇回流提取2次每次2 h，趁熱濾過，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至藥材量1∶1的濃縮液，放至室溫后，精密吸取提取液0.2 mL，置10 mL的容量瓶中，用流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣，計(jì)算芥子堿硫氰酸鹽的含量，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽平均提取率為 8.58 mg/g，RSD為 0.83%，浸膏平均收率為15.86% ，RSD為1.36%。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

曾采用水提醇沉和乙醇回流方法提取對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明乙醇回流法提取芥子堿硫氰酸鹽提取率稍高一些，而浸膏收率相對(duì)較少，同時(shí)藥材的合并提取還應(yīng)該考慮到其他成分的影響，因此采用正交試驗(yàn)繼續(xù)考察提取時(shí)間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數(shù)對(duì)提取率的影響，優(yōu)選出了最佳的提取工藝，以保證能夠提取到最大量的有效成分，為后面進(jìn)行的平喘巴布劑體內(nèi)外透皮吸收特性的研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 考察指標(biāo)及測(cè)定方法的選擇

芥子堿硫氰酸鹽的HPLC法為《中國(guó)藥典》2010年版[8]收載，以控制芥子藥材的質(zhì)量，因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定芥子堿硫氰酸鹽的含量為考察指標(biāo)，在一定程度上反映芥子有效成份的濃度，也為進(jìn)一步的透皮吸收試驗(yàn)及制劑研究奠定了基礎(chǔ)。芥子堿為季胺類生物堿，因而在弱酸性溶液中穩(wěn)定，在堿性條件易分解為芥子酸和膽堿，故本實(shí)驗(yàn)在弱酸性條件下進(jìn)行有利于被測(cè)成分的分離[9]。芥子堿硫氰酸鹽的測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法較多，為了獲得較好的峰形和分離效果，在流動(dòng)相中加入3%醋酸，梯度洗脫[10-11]，或加入0.08 mol/L磷酸二氫鉀[12]，本實(shí)驗(yàn)參考藥典選擇后者，并對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，方法學(xué)考察證實(shí)本方法精密度高，穩(wěn)定性好，可作為后續(xù)研究的測(cè)定方法。

[1]劉龍群，徐麗華，戴嘉.中藥穴位敷貼治療支氣管哮喘的療效觀察[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2012，21（10）：1573-1579.

[2]鄒積寶，孫永強(qiáng).中藥穴位貼敷治療支氣管哮喘研究進(jìn)展[J].中醫(yī)外治雜志，2009，18（1）：52-53.

[3]張學(xué)梅，劉凡亮，梁文波，等.白芥子提取物的鎮(zhèn)咳祛痰及平喘作用研究[J].中草藥，2003，34（7）：635-637.

[4]王緒穎，賈曉斌，陳彥.延胡索總生物堿的提取純化工藝研究[J].中成藥，2010，32（11）：1899-1904.

[5]鄭維法.甘遂醇提物中4種二萜類化合物的體內(nèi)抗病毒活性研究[J].中草藥，2004，35（1）：65-68.

[6]張會(huì)宗，向紹杰，孟莉，等.中藥細(xì)辛不同提取物平喘活性分析[J].遼寧中醫(yī)雜志，2011，38（3）：551-552.

[7]馮寶民，余正江，李帆，等.白芥子化學(xué)成分的研究[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（6）：43-45.

[8]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：149-150.

[9]杜松云，李其蘭，余軍.RP-HPLC法測(cè)定白芥子中芥子堿硫氰酸鹽的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（27）：2126-2128.

[10]尹珉，王宏，曾祖平，等.HPLC法測(cè)定喘寧巴布劑中芥子堿硫氰酸鹽的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（1）：21-22.

[11]黃云，張慧芬，王文喜，等.咳喘三伏貼中芥子堿硫氰酸鹽的超聲提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（1）：23-25.

[12]王海波.不同產(chǎn)地白芥子和黃芥子中芥子堿硫氰酸鹽的含量比較[J].中醫(yī)研究，2012，25（1）：68-70.