金屬蛋白酶、表皮生長因子受體、血管內皮生長因子在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

尹志永 王興波 陳麗娜 任士俊 趙 金 楊大勇

1.河北省秦皇島市第二醫院胸外科，河北秦皇島 066600；2.河北省秦皇島市第二醫院病理科，河北秦皇島 066600；3.河北省秦皇島市第二醫院麻醉科，河北秦皇島 066600

近年來，世界各國肺癌的發病率和病死率均呈上升趨勢，在多數發達國家，肺癌被列為惡性腫瘤死因的第1位。近70%非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者在確診時已經是晚期，而外科手術切除后3年生存率仍較低[1]。肺癌的侵襲和轉移仍是死亡的主要原因，也是目前治療的難點。本文通過檢測NSCLC組織中金屬蛋白酶9（MMP9）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子（VEGF）的表達情況，探討MMP9、EGFR、VEGF與肺癌發生發展的關系，并應用生存分析的方法來分析影響病情及療效的若干暴露因素的作用大小和方向，對判斷其惡性程度和估計預后具有一定的指導意義，也是臨床醫學研究中較先進的研究手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河北省秦皇島市第二醫院 （以下簡稱 “我院”）2008年1月～2009年12月手術切除且經常規病理證實的NSCLC標本40例作為NSCLC組，其中男22例，女18例，年齡30～76歲，中位年齡62歲。良性肺組織標本10例（炎性假瘤7例及結核球3例）作為對照組，其中男6例，女4例，年齡45～74歲，中位年齡67歲。在性別、年齡方面NSCLC組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 NSCLC組中有吸煙史（吸煙總量≥100支/年）24例，無吸煙史16例；腺癌34例，鱗癌5例，未分化癌1例；有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移16例；生存時間＜3年28例，≥3年12例；采用國際抗癌聯盟2009年修訂的肺癌分期標準[2]進行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期20例，Ⅲ期14例。80%的患者術后予以鉑類為基礎的2～4個療程的化療。納入的病例要求切緣陰性，術后生存期3個月以上。隨訪截止時間為2013年1月。隨訪率為100%。

1.2 方法

手術切除的肺癌組織于10%中性甲醛溶液固定12 h后取材，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片 4 μm 厚，60℃烤片 2 h，經二甲苯-梯度乙醇脫蠟，自來水沖洗，短暫入蒸餾水待做免疫組化。免疫組化試劑盒采用MAXvision二步法，抗體選用MMP9、EGFR、VEGF單抗、二氨基聯苯酸（DAB）顯色劑，免疫組化試劑均購自福州邁新生物技術開發有限公司。根據每種抗體要求，進行相應的抗原修復，PBS沖洗3次×3 min，每張切片滴加50 μL正常非免疫動物血清，37℃孵育[3]。除去血清，每切片滴加50 μL一抗，37℃孵育 60 min，PBS液沖洗 3次×3 min后，滴加 50 μL生物素標記的二抗 （MAXvision），37℃孵育15 min，PBS液沖洗3次×3 min，新鮮配制的DAB液顯色，蘇木精復染，封片后顯微鏡下觀察。

1.3 結果判定

采用單盲法閱片，顯色部位應正確，無背景顯色。MMP9抗原存在于惡性腫瘤細胞及其周圍血管內皮細胞和增生的纖維母細胞的胞漿中；EGFR抗原是一種轉膜蛋白，存在于惡性細胞胞漿內；VEGF抗原可誘導血管新生，存在于腫瘤細胞漿內。因此，MMP9胞漿顯色、EGFR胞漿/胞膜顯色、VEGF胞漿顯色，顏色為棕黃色。腫瘤細胞無顯色為“-”，顯色細胞數＜20%為+，20%～50%為++，＞ 50%及以上為+++。 其中“++”和“+++”為高表達，“-”和“+”為低表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，生存分析的比較用Kaplan-Meier生存曲線，影響遠期療效的相關因素分析采用Cox多因素回歸分析法，所有檢驗和P值均為雙側，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DAB染色

對照組：固有層中以淋巴細胞為主，MMP9、EGFR、VEGF蛋白較少，形態較規則，體積較小。見圖1。

NSCLC組MMP9、EGFR、VEGF的表達位于細胞漿。見圖2。

圖1 相關蛋白在對照組中的表達情況（DAB，100×）

圖2 相關蛋白在非小細胞癌組中的表達情況（DAB，100×）

2.2 MMP9、EGFR、VEGF在NSCLC組及對照組中的表達

MMP9、EGFR、VEGF在NSCLC組織中表達率分別為 65%（26/40）、50%（20/40）、55%（22/40）， 顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 MMP9、EGFR、VEGF蛋白的表達與非小細胞肺癌預后的關系

40例NSCLC患者從手術日期開始隨訪，至患者死亡結束，未死亡的至2013年1月截止。用Kaplan-Meier生存分析，MMP9、EGFR、VEGF蛋白陽性表達組與陰性表達組在非小細胞肺癌患者3年生存率相比，差異有統計學意義（P＜0.05），三種蛋白均陽性表達者，預后最差。見圖3。

表1 非小細胞肺癌及肺良性病變組織中MMP9、EGFR、VEGF的表達水平[n（%）]

圖3 3種蛋白在非小細胞肺癌組織中陽性表達組與陰性表達組患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 非小細胞肺癌患者術后遠期療效影響因素的分析

以遠期療效為因變量，年齡、病程、病理分期、有無吸煙史、有無淋巴結轉移等為自變量進行Cox多因素回歸分析。結果表明，遠期療效與年齡、病程、病理分期、吸煙史、淋巴結轉移相關（P<0.05）。見表2。

表2 非小細胞肺癌危險因素的Cox多因素回歸分析

3 討論

MMP9是一類鋅離子依賴的、催化細胞外基質降解的重要蛋白水解酶，能夠破壞局部組織結構，促進腫瘤生長；破壞基質屏障，利于腫瘤轉移；通過對ECM的改建，促進腫瘤新生血管的形成。Laak等[4]研究顯示，肺癌細胞確實能分泌大量MMP9和VEGF，促進腫瘤血管生成，提供腫瘤生長所需營養條件，促進腫瘤的轉移。鄭先杰等[5]研究表明MMP9在腺癌組織中表達最高，在癌旁組織表達較弱，在伴有淋巴結轉移組中表達增高。本研究結果顯示，MMP9在NSCLC組織中的表達水平明顯高于對照組（P<0.05）。淋巴結轉移組明顯高于無淋巴結轉移組，Ⅲ期組明顯高于Ⅰ＋Ⅱ期組。提示MMP9的高表達與肺癌的發生發展密切相關。

EGFR通過其細胞外區域與配體EGF、TNF-α等結合后，引起一系列的生物效應，在正常組織中調控細胞的生長、分裂等重要生理過程，是細胞增殖、黏附、分化等過程的關鍵調節因子。在癌組織中EGFR的高表達可以促進癌細胞的增殖和新生心血管的形成，促進癌細胞侵襲及遠處轉移[6-7]。王立波等[8]研究表明EGFR在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率明顯高于正常組織，且與分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移有關。本研究結果與報道基本一致，EGFR在NSCLC組織中的表達水平明顯高于對照組（P<0.05）。在伴有淋巴結轉移或TNM分期較晚的患者組織中呈高表達，提示EGFR的高表達促進了癌細胞的生長和增殖，加速了癌細胞的侵襲和轉移。VEGF是一組生長因子，主要由腫瘤細胞產生，小部分來自細胞間質，能促進新血管的形成和發育。血管形成在腫瘤生長、侵潤、轉移中起關鍵作用，受到一系列促進和抑制因子的調節，其中最重要的促進因子之一就是腫瘤細胞在生長過程中分泌的VEGF。胡雅兵[9]報道VEGF在非小細胞肺癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常對照組織，且與分化程度、TNM分期及有無淋巴結轉移有關。本研究結果發現VEGF在NSCLC組織中的表達水平明顯高于對照組（P<0.05）。淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組，Ⅲ期組顯著高于Ⅰ＋Ⅱ期組，說明VEGF也是NSCLC發生發展、侵襲和轉移過程中的一個重要因子，Yoshida等[10]的研究結果也支持這一觀點。

MMP9、EGFR和VEGF因其自身所具備的一些特異性，使其應用價值得到明顯提高，因此，近來受到國外腫瘤學領域學者的廣泛關注。其特點及應用范圍可歸納為兩大類：①由于MMP9、EGFR和VEGF在非小細胞肺癌的特異性表達，使其有望成為非小細胞肺癌的診斷和預后判定新標志；②有望成為抗瘤體新靶標，開拓腫瘤間質治療新途徑。這是因為MMP9、EGFR和VEGF基因組較穩定，抗原丟失和治療耐受的概率較小；MMP9、EGFR和VEGF是僅在局部表達的膜分子，不能分解為可溶性產物進入血液循環，保證了腫瘤局部存在豐富的MMP9、EGFR和VEGF靶標[11]。目前，國外在上述兩個方面的研究均取得較大進展，如已將鼠MMP9、EGFR和VEGF單克隆抗體F19用于臨床診斷，應用另一MMP9、EGFR和VEGF抗體BIBH1對非小細胞肺癌進行治療，效果明顯（Ⅱ期臨床研究）[12]。 經過研究發現，MMP9、EGFR、VEGF 在NSCLC組中的表達水平顯著高于對照組（P<0.05）。MMP9、EGFR、VEGF陽性表達率越高，生存時間越短。提示MMP9、EGFR與VEGF參與NSCLC的發生和發展，并起協同作用。影響NSCLC患者術后遠期療效的相關因素較多，與患者的年齡、病理分期、病程、吸煙史、淋包括巴結轉移。

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