犀角地黃湯對膠原誘導性關節炎大鼠模型滑膜組織中磷脂酶C-γ1表達的影響

李 茜 高 峰 楊學文

1.南京中醫藥大學針藥結合重點實驗室，江蘇南京 210046；2.南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇南京 210029

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）急性期發病迅速，病程持續，關節僵硬腫痛，甚至生活不能自理，給患者造成極大的痛苦。目前臨床治療方案多以大量使用激素及免疫抑制劑為主，這種方案主要有兩大問題：一是具有不可忽視的副作用；二是對一些不適宜使用激素或免疫抑制劑的患者無從下手。因而近年來中醫藥治療RA的作用越來越引起關注，從瘀熱的病理角度治療類風濕關節炎得到普遍認同[1]。本研究測定大鼠關節滑膜組織中磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）在大鼠膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型形成以及應用犀角地黃湯治療過程中的表達水平，目的在于進一步探討犀角地黃湯治療RA急性期的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

6～8 周齡雄性 SD 大鼠 45 只，體重（150±10）g，購于上海斯萊克實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑

犀角地黃湯（犀角、生地黃、芍藥、丹皮、虎杖、地龍）由南京中醫藥大學附屬醫院藥劑科配制。雞Ⅱ型膠原蛋白、完全福氏佐劑購自美國Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、DNA marker、Taq DNA聚合酶試劑盒購自大連TaKaRa公司；引物、探針委托Invitrogen公司合成：根據文獻[2]合成PLC-γ1（Forwards：5'-GTCGACCTCATCAGCTACTA-3'；Reverses：5'-GGCTGTTCTCATCCAGATGC-3'） ，采用看家基因磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）（Forwards：5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'；Reverses：5'-AGATCCACAACGGATACATT-3）作為內對照。

1.3 儀器

Eppen-dorf Centrifuge 5417R高速冷凍離心機、Biophotome-ter紫外可見分光光度計為德國Eppendorf公司產品；ABI7500實時熒光PCR儀為美國ABI公司產品；凝膠成像系統為日本Kodak公司產品。

2 方法

2.1 大鼠分組及CIA模型構建

2.1.1 分組 將6～8周齡雄性SD大鼠45只， 于清潔環境中適應性飼養1周后，應用隨機方法分為3組，即空白對照組，CIA模型組，犀角地黃湯實驗組，每組15只。給各組大鼠稱重，其周齡、體重差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。

2.1.2 CIA 模型構建 配置Ⅱ型膠原（CⅡ）乳劑：將 CⅡ溶于0.01 mol/L冰醋酸中，攪拌使其充分溶解，配置濃度為2 g/L并4℃過夜后，與同等體積的完全福氏佐劑在冰浴中充分攪拌混合，使其乳化制成CⅡ乳劑，最終配置濃度為1 g/L。將CⅡ乳劑以0.007 mL/g的劑量在模型組、實驗組大鼠的背部、尾根及足底部進行多點皮內注射，1周后重復注射1次加強免疫。空白對照組：將生理鹽水按照與CⅡ乳劑的相同劑量及部位對大鼠進行多點皮內注射。1周后同樣注射1次[3]。

2.2 動物模型的給藥

實驗組灌胃給予犀角地黃湯，根據體表面積公式換算大鼠與人的等效劑量后（200 g大鼠的給藥劑量=70 kg 人的給藥劑量×0.018），按 0.025 g/kg 體重給藥。空白對照組及模型組均以蒸餾水0.5 mL/d灌胃，每日1次，治療6周。

2.3 模型及治療評價

觀察各組大鼠的癥狀及治療過程，使用容積法測量大鼠后肢的腫脹度：用帶刻度的10 mL小試管裝水，固定大鼠，以脛骨下端內躁處為解剖標志點標記，將待測后肢（包括整個足掌）深入液面下，使液面達標記處，觀察并記錄水面上升數值。致炎后每5天測量1次，記錄容積，計算其關節腫脹度。腫脹度（%）=（Vt-V0）/V0×100%，其中，V0為造模前容積；Vt為造模后容積。結合病理切片評價模型建立是否成功以及藥物療效。

2.4 標本制備

在模型給藥后第42天將各組動物統一處死，取大鼠足踝關節滑膜組織，用無菌生理鹽水清洗后快速放入1%DEPC水處理過的凍存管中，入液氮保存。充分研碎冷凍組織后，置于加入1 mL Trizol的離心管中裂解，經過氯仿萃取、異丙醇沉淀、含7.5%DEPC乙醇洗滌過程后，將抽提出的RNA中加入30 μL DEPC水進行溶解，用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。計算RNA的濃度并取總RNA 2 μg進行逆轉錄，根據公式總 RNA（μg/mL）=A260×稀釋倍數×40 μg/mL。 逆轉錄采用二步法：①在0.2 mL離心管中加入模板總RNA 2 μg，50 pmol/μL oligo（dT）1 μL，補 DEPC 水至管內液體總體積達12 μL；加熱70℃ 5 min后冰上急冷5 min。②再加入400 U/μL RNAseinhibitor 200 U、10 mmol/L dNTP 1 μL、200 U/μL M-MLV 酶 1 μL、5×buffer 4 μL，補 DEPC 水至管內液體總體積達 20 μL。設定反應條件 42℃ 60 min、85℃ 5 min將RNA逆轉錄為cDNA，cDNA放置于-20℃保存。

2.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR檢測大鼠PLC-γ1 mRNA參照文獻[3]的反應條件，在ABI 7500實時熒光PCR儀上進行。讀出PLC-γ1 mRNA與GAPDH拷貝數，將PLC-γ1 mRNA的拷貝數除以相應標本GAPDH的拷貝數，從而得到PLC-γ1 mRNA相對表達量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對檢測數據進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 模型及治療評價

大鼠足-踝關節腫脹度的測定結果：模型組足-踝關節腫脹度明顯大于空白對照組（P＜0.01），實驗組足-踝關節腫脹度小于模型組（P＜0.05）。見表1。病理切片顯示：空白對照組關節腔滑膜組織未見炎性反應（圖1）；模型組關節腔滑膜組織可見炎癥細胞浸潤，纖維組織填充（圖2）；實驗組關節腔滑膜組織增生，有輕度充血（圖3）。結合以上實驗結果證明：大鼠關節炎模型造模成功，并證實犀角地黃湯對大鼠關節腫脹有抑制作用。

表1 不同時期各組大鼠關節腫脹度的變化（%，±s）

表1 不同時期各組大鼠關節腫脹度的變化（%，±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

空白對照組模型組實驗組15 15 15 0 31.73±1.81*29.76±1.56 0 28.31±1.43*24.77±1.29△0 27.66±1.27*21.75±1.16△0 27.14±1.36*18.74±0.12△組別 只數 10 d 20 d 30 d 40 d

圖1 空白對照組（HE染色，400×）

圖2 模型組（HE染色，400×）

圖3 實驗組（HE染色，400×）

3.2 PLC-γ1在各組大鼠關節組織中的表達情況

關節滑膜組織PLC-γ1表達組間差異有統計學意義（F=24.711，P<0.01）。模型組大鼠關節滑膜組織中PLC-γ1的相對表達量明顯高于空白對照組（P<0.01），實驗組PLC-γ1的相對表達量低于模型組（P<0.05）。 見表 2。

4 討論

PLC是參與調控細胞的增值分化等細胞代謝活動的重要物質之一，通常分為 PLC-β、PLC-γ、PLC-ε 和PLC-δ四大類型，其中每一類型還有亞型，如 PLC-γ分為PLC-γ1和 PLC-γ2兩個亞型。PLC-γ1在人體細胞中廣泛表達，而 PLC-γ2主要表達于造血干細胞[4]，其結構中含有水解磷酸酰肌醇二磷酸（PIP2）所必需的結構域。它將PIP2水解，產生了二酸基甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）這兩種第二信使。DAG能夠激活蛋白激酶C（PKC），并通過這一途徑參與調控許多細胞活動，特別是細胞分化和增殖。IP3能夠引起細胞內“鈣庫”中鈣離子（Ca2+）的釋放，激活鈣調蛋白（CAM）系統，并通過這一途徑使得細胞產生相應的生理效應[5]。Wells等[6]應用成纖維細胞、角蛋白細胞、軟組織上皮細胞、神經膠質細胞和癌細胞驗證了PLC-γ1為生長因子誘導的細胞活動增加所必需。血管內皮生長因子（VEGF）也正是通過與絡氨酸激酶（PTK）結合后激活PLC，并通過這一途徑參與調控細胞的增殖和分化的，從而誘導血管滲透性，這與血管新生和炎性反應相關[7]。

表2 PLC-γ1在各組大鼠關節組織中的表達情況（±s）

表2 PLC-γ1在各組大鼠關節組織中的表達情況（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

組別 只數 PLC-γ1相對表達量空白對照組模型組實驗組15 15 15 0.031±0.001 0.125±0.001*0.072±0.001*△

RA的病因至今仍不清楚，但它有可能和一些病原體的感染有關，有研究報道，類風濕關節炎患者出現關節炎癥狀之前有腸炎沙門菌、腸耶爾森菌、空腸彎曲菌、沙眼衣原體和肺炎衣原體等病原體的感染。這些病原微生物的感染有可能通過小分子非肽抗原、熱休克蛋白（HSP）等途徑激活T細胞，使其發揮細胞毒作用，導致靶細胞的損傷和破壞[8]。目前普遍認為RA的病理機制是以T細胞為主的多種輔助因子作用的免疫應答反應。有實驗表明，PLC-γ1能夠在細胞質膜區域鎖定LT細胞位點，并與其他信號分子協同累積LAT、GrbZ和PLC等活化 T細胞，證明PLC-γ1的生物學功能在免疫系統中起了重要作用[9]。RA的主要的病理學特征是滑膜的持續性增生、大量炎癥細胞浸潤、軟骨及骨質的破壞，這與病變滑膜組織中成纖維細胞、血管內皮細胞等的增殖、分化和遷移有關。例如，Smith等[10]通過顯微注射刺激PLC-γ的SH2和SH3結構區域，能夠促進PC12細胞和成纖維細胞生長并調控細胞周期。Bela等[11]認為，目前至少有兩種途徑參與調節細胞遷移，PLc-γ是通過與細胞內的PTK受體結合，使與受體結合的效應器活化，從而調節細胞遷移。另外，Kassis等[12]應用PLC抑制劑U73122可使體外表皮生長因子（EGF）誘導的人結直腸癌細胞系（LoVo）細胞的活動性明顯降低，并抑制其遷移。

綜上所述，運用犀角地黃湯治療RA急性期有效緩解患者癥狀的作用機制可能在于它可以降低促使與血管新生及組織細胞增生、遷移相關的VEGF、VEGFR2[13]、PLC-γ1的表達，可以對臨床用藥提供一定的實驗參考。

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