維甲酸相關核孤兒受體γt和4—1BB/4—1BBL在口腔扁平苔蘚中的表達及意義

張敬 李貞 王婧嬌等

[摘要] 目的 研究口腔扁平苔蘚（OLP）患者外周血中維甲酸相關核孤兒受體γt（RORγt）和4-1BB/4-1BBL mRNA的表達。方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）法檢測30例OLP患者和30例健康人外周血中RORγt和4-1BB/4-1BBL的基因表達水平。結果 在OLP患者中，RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表達水平顯著高于對照組（P<0.05），結果經2-ΔΔCT轉換后，OLP組3種基因mRNA表達水平分別是健康對照組的3.087、3.320和4.005倍。RORγt和4-1BB mRNA的表達水平無明顯相關性（P>0.05），4-1BB和4-1BBL mRNA表達水平呈正相關（r=0.455 0，P<0.05）。結論 RORγt和4-1BB/4-1BBL在OLP的發病中起了一定作用。

[關鍵詞] 維甲酸相關核孤兒受體γt； 4-1BB； 4-1BBL； 口腔扁平苔蘚

[中圖分類號] Q 786 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.019

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是發生于口腔黏膜的慢性炎癥性疾病，T細胞介導的免疫異常是其重要的發病因素。研究結果顯示：Th17細胞在自身免疫性炎癥中處于重要地位[1-2]。維甲酸相關核孤兒受體γt（retinoid-related orphan receptor γt，

RORγt）主要分布于CD4+和CD8+淋巴細胞內，作為

Th17細胞的特異性轉錄調節因子，在Th17細胞分化發育過程中發揮著重要作用[3]。共刺激分子4-1BB/4-

1BBL屬于腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體超家族成員，主要表達在活化的CD4+T細胞、CD8+T細胞和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）表面，其以受體配體相互作用的方式傳導信號，維持T細胞的活化狀態，延長其免疫應答效應[4]。本研究用實時熒光定量

聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitativepoly-merase chain reaction，FQ-PCR）方法檢測OLP患者和健康人外周血中RORγt及4-1BB/4-1BBL的表達，比較RORγt及4-1BB/4-1BBL mRNA在2組之間的表達差異和相關性，初步探索其與OLP的關系，為OLP尋找可能的致病機制，并為治療新策略的研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 對照組 30例健康人外周血標本為自愿者捐獻，其中男17例，女13例。年齡為24～46歲，均無全身及口腔黏膜疾病診斷，肝腎功能正常，排除感染等可能影響免疫狀態的情況。本研究通過醫院倫理委員會批準，志愿者知情同意。

1.1.2 OLP組 30例OLP患者外周血標本來自寧夏醫科大學附屬醫院口腔科門診初次就診的OLP患者（均經病理確診）[5]，其中男12例，女18例，年齡為28～72歲，均排除合并其他自身免疫性疾病，未接受任何激素和免疫抑制劑治療，排除感染等可能影響免疫狀態的情況。

1.2 主要試劑和儀器

全血RNA提取試劑、逆轉錄試劑、FQ-PCR試劑均由廣州達安生物技術有限公司合成。凝膠成像儀Gel Doc XR（BIO-RAD公司，美國），熒光定量

PCR儀（PRISM 7300，ABI公司，美國），臺式高速冷凍離心機（Z36HK，HERMLE公司，德國），DU800紫

外分光光度儀（Beckman公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物的設計與合成 實驗引物序列見表1。引物的設計經查詢基因庫和通過Primer Premier 5.0軟件完成，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 樣本處理 取外周靜脈血各2 mL，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝

后，按全血提取試劑說明提取總RNA，用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，反應體系為：Oligo（dT）18引物1 μL，RNA模板5 μL（0.1 ng～5 μg），5×逆轉錄buffer 4 μL，逆轉錄酶1 μL，DEPC水加至20 μL。反應條件為：42 ℃ 60 min（逆轉錄反應），然后70 ℃

5 min（逆轉錄酶的失活反應），終止反應。合成的

cDNA于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 FQ-PCR檢測 采用SYBR Green Ⅰ染料法，加樣過程中避光操作。反應體系為：2×SYBR Green Mix 12.5 μL，上游引物F（10 μmol·L-1）0.5 μL，下游引物R（10 μmol·L-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.05 μL，

dd水10.5 μL，總體積20 μL。

反應條件為：將制備好的檢測樣本上機。本實驗采用三步法：50 ℃預處理2 min，1個循環；95 ℃預變性10 min，1個循環；然后95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環；加收集熔解曲線反應條件。每個標本做2個復孔。擴增結束后系統軟件自動繪制擴增曲線和熔解曲線。

1.3.4 數據分析 對RORγt、4-1BB、4-1BBL基因與內參基因β-actin進行PCR擴增，反應后，進入結果分析界面。通過比較目的基因的CT值（CT值為每個

反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數）與內參照基因β-actin的CT值之差，即ΔCT來表示RORγt、4-1BB、4-1BBL基因與內參基因β-actin的相對表達量，計算ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCT（OLP組）-

ΔCT（對照組），目的基因在OLP組相對于對照組的表達差異倍數用2-ΔΔCT來表示，即是OLP患者與對照組相比，所檢測目的基因的相對表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析，數據用均數±標準差（x±s）表示，FQ-PCR數據為計量資料，所有實驗數據經正態性檢驗以明確其是否正態性分布，2組間采用t檢驗分析，相關分析采用Pearson直線相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總RNA質量

紫外分光光度儀測定A260/A280，所有樣本比值為1.8～2.0，說明總RNA質量較好。

2.2 RORγt、4-1BB和4-1BBL mRNA的表達

在30例健康人外周血和30例OLP患者外周血中，RORγt、4-1BB、4-1BBL基因均有表達，且在OLP組中的表達明顯高于對照組（表2～4），以健康人外周

血中RORγt mRNA的表達量作為標準，在此基礎上比較OLP組RORγt、4-1BB、4-1BBL基因的相對表達量。OLP組中RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表達量分別是對照組的3.087、3.320、4.005倍。

2.3 RORγt、4-1BB和4-1BBL基因表達水平的相關性

2.3.1 RORγt和4-1BB基因表達水平的相關性 對OLP組RORγt和4-1BB表達水平進行直線相關分析，繪制兩者散點圖，可見散點分布雜亂，無明顯規律，

相關性分析結果表明2組數據關系不密切（r=0.332 2，

P>0.05）（圖1）。

3 討論

目前許多研究表明：OLP是一種由T細胞介導的免疫反應性疾病。CD4+T淋巴細胞及其分泌的細胞因子在其發病機制中起著關鍵作用[5]，根據產生細

胞因子和生物學功能的不同，將CD4+T淋巴細胞分為Th1、Th2及Tregs細胞亞群[6]。近年來，研究發現了

一種新型的Th細胞亞群，不同于Th1、Th2及Tregs細胞，以分泌白細胞介素（interleukin，IL）-17為主，被

命名為Th17細胞[7-8]，其在炎性反應、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等疾病中發揮了重要的作用。現已證實RORγt是促進Th17細胞分化、調節其功能的特異性轉錄調節因子[9]。RORγt基因是RORC的一種剪接變異體，RORγt作為輔助性Th17細胞的特異性轉錄調節因子，主要分布于CD4+和CD8+淋巴細胞內。在體外實驗中發現，將CD4+T細胞中的RORγt基因敲除后則不表達IL-17，而通過基因載體將RORγt過表達，則發現CD4+T細胞不需要其他外來的細胞因子便可以表達IL-17。在實驗性變態反應性腦脊髓炎（experimentally allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型中，RORγt缺陷的小鼠腸固有層IL-17表達明顯降低，且腸道易于感染，EAE發病延緩，病情減輕，由此證實了RORγt在Th17細胞分化中起關鍵性的作用[3]。

本實驗結果顯示30例OLP患者和30例健康人外周血中均檢測到RORγt mRNA的陽性表達；OLP組RORγt mRNA表達量明顯高于對照組（P<0.05），表

達水平是對照組的3.087倍，顯示OLP患者RORγt基因表達相對于正常人上調。在系統性紅斑狼瘡、過敏性紫癜患者外周血中檢測到RORγt mRNA的表達量均較對照組顯著性增多。結果提示OLP患者RORγt上調導致T細胞趨向Th17分化增多，導致一系列炎癥及自身免疫性反應。

研究[10]發現：4-1BB是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員，主要表達在活化的CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞表面。4-1BBL相對分子質量為34 000，屬腫瘤壞死因子（tu-

mor necrosis factor，TNF）超家族成員，其表達在B細胞和活化的T細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞（dendritic cells，DC）、濾泡樹突狀細胞（follicle dendritic cell，FDC）上[11-12]。4-1BB/4-1BBL是在T細胞初次和再次應答過程中一對重要的共刺激分子，其以受體配體相互作用的方式傳導信號，能有效刺激CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化，分泌細胞因子及調節其增殖和存活，延長其免疫應答效應。4-1BB/4-1BBL在系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、強直性

脊柱炎等自身免疫性疾病外周血淋巴細胞上均有異常表達。

本研究結果顯示30例OLP患者和30例健康人外周血中均檢測到4-1BB mRNA和4-1BBL mRNA陽性表達，且在OLP患者中的表達均明顯高于健康對照組（P<0.05），提示4-1BB、4-1BBL的異常表達參與了OLP的發病，OLP患者可能存在CD4+T細胞的活化、增殖和分化異常，這也可能是其參與免疫炎性反應發生發展的原因之一。

本研究對OLP組RORγt和4-1BB表達水平進行相關分析，結果顯示2組數據關系不密切，RORγt和4-1BB在OLP患者的表達無相關性（P>0.05），提示初始CD4+T細胞在第一信號和4-1BB/4-1BBL第二信號的共同作用下活化，在RORγt存在的的條件下，分化為Th17細胞，進而執行相應的生物學功能。這是一個非常復雜而精細的過程，還需要應用多種不同的方法或更進一步深入的研究來探索其機制。對OLP組4-1BB、4-1BBL mRNA的表達水平作出相關分析，結果顯示4-1BB與4-1BBL表達呈正相關（P<0.05），

分析認為當機體受到外界免疫刺激后，引發了共刺激信號4-1BB/4-1BBL的異常激活，使兩者表達均增高，因此兩者呈正相關，這也提示這對共刺激分子表達水平的共同升高可能在OLP的發病中起一定的作用，但具體的機制還需要更深入的研究。

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（本文編輯 杜冰）