塞來昔布提高耐長春新堿細胞株KB/VCR細胞化療敏感性的研究

閆怡軒 李偉忠

[摘要] 目的 研究選擇性環氧化酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布影響口腔癌耐長春新堿細胞株KB/VCR細胞對長春新堿敏感性的效應，探討其作用機制。方法 采用MTT法分別檢測塞來昔布組、長春新堿組、塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+前列腺素E2（PGE2）組對KB/VCR細胞的生長抑制作用，用Western印跡法檢測P-糖蛋白（P-gp）、Bcl-2和Bcl-XL的表達，流式細胞術檢測塞來昔布對KB/VCR細胞凋亡的影響。采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。結果 塞來昔布+長春新堿組的細胞生長抑制率高于塞來昔布組、長春新堿組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組（P<0.01）。塞來昔布+長春新堿組和塞來昔布組P-gp的表達顯著低于長春新堿組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組（P<0.01），塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組和塞來昔布組Bcl-2、Bcl-XL的表達顯著低于長春新堿組（P<0.01）。塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組細胞凋亡率均顯著高于長春新堿組、塞來昔布

組，塞來昔布+長春新堿+PGE2組細胞凋亡率顯著低于塞來昔布+長春新堿組（P<0.01）。結論 塞來昔布可以通過下調P-gp的表達及促進細胞凋亡，增強長春新堿耐藥株KB/VCR細胞對長春新堿的敏感性。

[關鍵詞] KB/VCR細胞； 多藥耐藥； P-糖蛋白； 環氧化酶-2抑制劑； 細胞凋亡

[中圖分類號] R 739.86 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.018

口腔癌是常見的口腔頭頸部惡性腫瘤之一，近年來口腔癌的發病率呈現明顯增高趨勢，已成為威脅人類健康的重要因素之一。化療是口腔癌重要的輔助治療方法之一，目前化療所面臨的主要問題是癌細胞對化療藥物的敏感性下降，導致多藥耐藥（multidrug resistant，MDR）的產生，使癌細胞產生

抵抗廣譜化療藥物的能力。

近來研究[1-3]發現，選擇性環氧化酶-2（cycloxy-genase-2，COX-2）抑制劑可抑制許多類型癌細胞的生長及誘導細胞凋亡，增強抗腫瘤藥物對癌細胞的毒性作用。COX-2抑制劑的抗腫瘤活性的作用機制包括抑制細胞分裂周期、誘導細胞凋亡和抑制腫瘤新生血管生成等。此外有研究[4-5]認為，COX-2抑制劑可以通過調節ABC轉運家族中的膜轉運蛋白活性而增強腫瘤對化療藥物的敏感性。研究[6]發現，在腫瘤組織內COX-2與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達呈顯著性正相關。本課題組前期研究[7-8]也證實，選擇性COX-2抑制劑塞來昔布可顯著增強順鉑對人舌癌細胞株Tca8113細胞的生長抑制作用，增加耐長春新堿細胞株KB/VCR細胞內化療藥物的蓄積[9]。本實驗研究塞來昔布對口腔上皮癌耐長春新堿細胞株KB/VCR化療敏感性的影響，探討塞來昔布增強腫瘤細胞對化療藥物敏感性的作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

長春新堿（Vincristine，VCR）（Merck公司，德國），塞來昔布膠囊（Pfizer公司，美國），MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美國），RPMI-1640、胎牛血清（Invitrogen公司，美國），P-gp、Bcl-2、Bcl-XL及β-肌動蛋白鼠抗人單克隆抗體、熒光標記的羊抗鼠二抗（Epitomics公司，美國），人

口腔表皮樣癌耐長春新堿細胞株KB/VCR、人口腔表皮樣癌細胞KB、膜聯蛋白（annexin）V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）細胞凋亡檢測試劑盒、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒（南京凱基生物

科技發展有限公司）。

1.2 細胞培養

KB/VCR細胞用含有10%胎牛血清和200 nmol·L-1 VCR的RPMI-1640培養基于37 ℃、5%CO2環境中培養，KB細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5%CO2環境中培養。

1.3 MTT法檢測

將處于對數生長期的KB/VCR細胞，以每孔2×103個細胞的密度接種于96孔板中，常規培養24 h，細胞貼壁后分別加入含10 μmol·L-1塞來昔布（塞來昔布組）、1.5 μmol·L-1長春新堿（長春新堿組）、10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿（塞來昔布+長春新堿

組）及10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿+100 μg·L-1前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）（塞

來昔布+長春新堿+PGE2組）的培養基，終液量為每孔200 μL，另外以未添加藥物的RPMI-1640培養基作為空白對照。繼續培養24、48、72 h后，加入終質量濃度1 g·L-1的MTT溶液100 μL，繼續培養4 h，棄上清后每孔加入150 μL DMSO，緩搖15 min，酶標儀（EL×800型，BioTek公司，美國）490 nm波長下檢測光密度（optical density，OD）值。每孔設4個復孔，取其平均值，重復3次。按下述公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=1-（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。用金正均法計算塞來昔布與長春新堿兩藥聯用后的合并效應（q值）：q=EA+B /（EA+EB-EA·EB ）。其中EA代

表A藥單獨給藥時的效應，EB代表B藥單獨給藥時的效應，EA+B代表A、B兩藥合并給藥后的效應，0.85≤q≤1.15為相加作用，q>1.15為協同作用，q<0.85為拮抗作用。

1.4 Western印跡法檢測細胞P-gp、Bcl-2、Bcl-XL

的表達

將KB/VCR細胞分別用含10 μmol·L-1塞來昔布（塞來昔布組）、1.5 μmol·L-1長春新堿（長春新堿組）、

10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿（塞來昔布+長春新堿組）及10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿+100 μg·L-1 PGE2（塞來昔布+長春新堿+

PGE2組）的培養基，于37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。然后收集細胞并用冰PBS液洗滌3次。用含1%Triton X-100的細胞裂解液裂解細胞。收取總蛋白，按照常規的方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dod-

cyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、轉膜。一抗為鼠抗人P-gp單克隆抗體（1∶

1 000）、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體（1∶400）、鼠抗人Bcl-XL單克隆抗體（1∶400）、鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗

體（1∶2 000），二抗為熒光標記的羊抗鼠抗體（1∶300），進行抗原抗體反應，然后進行熒光顯色并測定反應條帶灰度值，以β-肌動蛋白作為內參，計算相對灰度值，重復3次。

收集相同數量的KB和KB/VCR細胞，提取總蛋白質，按常規方法進行SDS-PAGE、轉膜。一抗為鼠抗人P-gp單克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗體（1∶2 000），二抗為熒光標記的羊抗鼠抗體（1∶300），進行抗原抗體反應，然后進行熒光顯色并測定反應條帶灰度值，以β-肌動蛋白作為內參，計算相對灰度值，重復3次。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期的KB/VCR細胞按每毫升1×106個接種于6孔板中，細胞貼壁后，分別加入含10 μmol·L-1塞來昔布（塞來昔布組）、1.5 μmol·L-1長春新堿（長春新堿組）、10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿（塞來昔布+長春新堿組）及10 μmol·L-1塞來昔布+1.5 μmol·L-1長春新堿+100 μg·L-1 PGE2（塞來昔布+

長春新堿+PGE2組）的培養基10 μmol·L-1，繼續培養48 h。收集細胞后加入500 μL結合緩沖液（Binding Buffer）懸浮細胞，加入5 μL FITC標記的膜聯蛋白V

熒光探針混勻，再加入5 μL碘化丙啶混勻，室溫下避光反應10 min，流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.6 統計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，多樣本均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD法，方差不齊用Dunnett法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 塞來昔布聯合長春新堿對KB/VCR細胞的生長

抑制作用

MTT法檢測結果表明，作用KB/VCR細胞24、48、72 h后，塞來昔布+長春新堿組的細胞生長抑制率高于塞來昔布組、長春新堿組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組（P<0.01）（表1）。塞來昔布與長春新堿聯用在24、48、72 h時的q值分別為1.160、1.282、1.287，均為協同作用。這表明，塞來昔布聯合長春新堿可顯著增強長春新堿對KB/VCR的生長抑制作用。

2.2 P-gp、Bcl-2、Bcl-XL的表達

Western印跡檢測結果表明：1）塞來昔布+長春新堿組和塞來昔布組P-gp的表達顯著低于長春新堿組、對照組及塞來昔布+長春新堿+PGE2組，塞來昔布+長春新堿+PGE2組P-gp的表達顯著低于長春新堿組和對照組（P<0.01）（圖1）；塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組和塞來昔布組Bcl-2、Bcl-XL的表達都顯著低于長春新堿組和對照組（P<0.01），塞

來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組和塞來昔布組之間Bcl-2、Bcl-XL的表達則無統計學差異（P>0.05）（圖2）。2）KB/VCR細胞P-gp的表達高于

KB細胞（P<0.01）（圖3）。

1：對照組；2：長春新堿組；3：塞來昔布組；4：塞來昔布+長春新堿組；5：塞來昔布+長春新堿+PGE2組。

2.3 塞來昔布對KB/VCR細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測表明：對照組、長春新堿組、塞來昔布組、塞來昔布+長春新堿組和塞來昔布+長春新堿+PGE2組的細胞凋亡率分別為3.84%±1.52%、13.61%±1.45%、24.73%±2.64%、58.07%±5.36%和41.74%±3.17%。塞來昔布+長春新堿組、塞來昔布+長春新堿+PGE2組細胞凋亡率均顯著高于對照組、長春新堿組、塞來昔布組（P<0.01）；塞來昔布+長春新堿+PGE2組細胞凋亡率顯著低于塞來昔布+長春新堿組（P<0.01）。

3 討論

化療是口腔癌的重要輔助治療方法之一，但是長期化療所導致腫瘤細胞耐藥性的產生已經成為癌癥治療的主要障礙之一。癌細胞耐藥性的產生可能與外排泵的活性增加、藥物的吸收減少、解毒酶的激活、藥物作用靶點的改變以及細胞凋亡減少等有關[10]。

在人惡性腫瘤的研究中發現，P-gp的表達水平與腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性以及腫瘤患者的生存率成負相關。近年來研究發現，在腫瘤組織內COX-2與P-gp的表達呈顯著性正相關。Nardone等[11]采用免疫組織化學方法在幽門螺桿菌陽性的胃癌患者中發現COX-2與P-gp表達顯著相關。Lee等[12]研究發現犬移行細胞癌中P-gp與COX-2的表達成正相關。Fantappiè等[13]也證實了COX-2與P-gp的表達存在相

關性，在多藥耐藥腫瘤細胞中兩者的表達都顯著增加。這些研究均證明，在多藥耐藥腫瘤組織中COX-2與P-gp的表達都顯著增強。本研究也證實，耐長春新堿細胞株KB/VCR細胞P-gp的表達顯著高于非耐藥細胞株KB細胞，這表明P-gp表達量的高低與細胞敏感性的產生具有正相關關系。本實驗進一步研究能否通過調控腫瘤組織中COX-2酶的活性進而調控P-gp的表達，從而影響腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。

本研究證實，低濃度COX-2抑制劑10 μmol·L-1塞來昔布可明顯增強長春新堿對KB/VCR細胞的生長抑制作用，經塞來昔布處理后的KB/VCR細胞與未經塞來昔布處理的相比，P-gp的表達量明顯降低。這提示COX-2抑制劑塞來昔布對KB/VCR細胞P-gp的表達具有明顯的抑制作用。經過加入外源性的PGE2后，P-gp的表達量增加。因此，塞來昔布能通過抑制P-gp的表達使細胞內長春新堿蓄積增多、細胞內藥物濃度增加，進而增加長春新堿對KB/VCR的細胞毒性作用，而塞來昔布抑制P-gp表達的途徑在一定程度上是通過PGE2途徑實現的。有關COX-2抑制劑調節P-gp表達的機制尚需進一步的研究。目前認為MDR-1基因啟動子可能含有激活蛋白1（activator pro-tein-1，AP-1）和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）結合位點，這可能與MDR-1基因的表達有關。

Tegeder等[14]研究證實，非類固醇抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drags，NSAIDS）如布洛芬可通過

COX-2依賴途徑直接抑制轉錄因子AP-1和NF-κB，下調相關基因如COX-2或腫瘤壞死因子（tumor ne-

crosis factor，TNF-α）等的表達來抑制炎癥過程。另外有研究[15]發現，塞來昔布可以通過抑制轉錄因子

AP-1和NF-κB的表達，從而抑制乳腺癌細胞P-gp的表達。

Bcl-2、Bcl-XL是Bcl-2家族中一類抗凋亡的細胞死亡負調節因子，在細胞受到外界刺激時能保護細胞免于凋亡[16-17]。Fantappiè等[13]研究證實，塞來昔布可通過下調Bcl-2、Bcl-XL的表達促進耐藥肝癌細胞的凋亡。本研究結果與之相一致，塞來昔布具有誘導及促進長春新堿誘導KB/VCR細胞凋亡的作用。塞來昔布聯合長春新堿處理細胞后，KB/VCR細胞Bcl-2、Bcl-XL的表達明顯減少。其機制可能與以下兩方面有關，一是P-gp表達的降低導致細胞內長春新堿的濃度增高，促進了長春新堿對細胞凋亡的誘導作用；二是塞來昔布處理細胞后抑制了Bcl-2、Bcl-XL的表達，從而促進細胞的凋亡。但是塞來昔布抑制Bcl-2、Bcl-XL表達的途徑尚不確定，實驗中加入外源性的PGE2后并不能使Bcl-2、Bcl-XL的表達增加，因此塞來昔布下調KB/VCR細胞Bcl-2、Bcl-XL的表達可能是通過非PGE2依賴途徑實現的。

本研究結果表明，塞來昔布可以增強長春新堿對KB/VCR細胞的毒性作用，這種作用與抑制P-gp的表達和促進細胞凋亡有關，為進一步理解COX-2在腫瘤細胞多藥耐藥性的產生及其COX-2抑制劑增強腫瘤細胞化療敏感性的機制提供幫助。

[參考文獻]

[1] Yu L， Wu WK， Li ZJ， et al. Enhancement of doxorubicin cytot-

oxicity on human esophageal squamous cell carcinoma cells by in-

domethacin and 4-[5-（4-chlorophenyl）-3-（trifluoromethyl）-1H-

pyrazol-1-yl] benzenesulfonamide（SC236） via inhibiting P-glyco-

protein activity[J]. Mol Pharmacol， 2009， 75（6）：1364-1373.

[2] Kim SH， Kim SH， Song YC， et al. Celecoxib potentiates the an-

ticancer effect of cisplatin on vulvar cancer cells independently of

cyclooxygenase[J]. Ann N Y Acad Sci， 2009， 1171：635-641.

[3] Li WZ， Huo QJ， Wang XY， et al. Inhibitive effect of celecoxib on

the adhesion and invasion of human tongue squamous carcinoma

cells to extracellular matrix via down regulation of MMP-2 ex-

pression[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat， 2010， 93（3/4）：113-

119.

[4] Zrieki A， Farinotti R， Buyse M. Cyclooxygenase-2 inhibitors pre-

vent trinitrobenzene sulfonic acid-induced P-glycoprotein up-re-

gulation in vitro and in vivo[J]. Eur J Pharmacol， 2010， 636（1/

2/3）：189-197.

[5] Zatelli MC， Luchin A， Piccin D， et al. Cyclooxygenase-2 inhibitors

reverse chemoresistance phenotype in medullary thyroid carcinoma

by a permeability glycoprotein-mediated mechanism[J]. J Clin En-

docrinol Metab， 2005， 90（10）：5754-5760.

[6] Raspollini MR， Amunni G， Villanucci A， et al. Increased cyclooxy-

genase-2（COX-2） and P-glycoprotein-170（MDR1） expression is

associated with chemotherapy resistance and poor prognosis. Ana-

lysis in ovarian carcinoma patients with low and high survival[J].

Int J Gynecol Cancer， 2005， 15（2）：255-260.

[7] Li WZ， Wang XY， Li ZG， et al. Celecoxib enhances the inhibi-

tory effect of cisplatin on Tca8113 cells in human tongue squa-

mous cell carcinoma in vivo and in vitro[J]. J Oral Pathol Med，

2010， 39（7）：579-584.

[8] 李偉忠， 王曉燕， 李祖國， 等. 塞來昔布聯合順鉑對人舌癌Tca8113

細胞移植瘤的生長抑制作用[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2010， 17（8）：

579-583.

Li Weizhong， Wang Xiaoyan， Li Zuguo， et al. Inhibitory effect of

celecoxib combined with cisplatin on xenografts of Tca8113 cells

in vivo[J]. Chin J Cancer Prevention Treatment， 2010， 17（8）：579-

583.

[9] Yan YX， Li WZ， Huang YQ， et al. The COX-2 inhibitor Cele-

coxib enhances the sensitivity of KB/VCR oral cancer cell lines

to Vincristine by down-regulating P-glycoprotein expression and

function[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat， 2012， 97（1/2）：29-

35.

[10] Shain KH， Dalton WS. Cell adhesion is a key determinant in de

novo multidrug resistance（MDR）： New targets for the prevention

of acquired MDR[J]. Mol Cancer Ther， 2001， 1（1）：69-78.

[11] Nardone G， Rocco A， Vaira D， et al. Expression of COX-2， mPGE-

synthase1， MDR-1（P-gp）， and Bcl-xL： A molecular pathway of

H pylori-related gastric carcinogenesis[J]. J Pathol， 2004， 202（3）：

305-312.

[12] Lee JY， Tanabe S， Shimohira H， et al. Expression of cyclooxyge-

nase-2， P-glycoprotein and multi-drug resistance-associated pro-

tein in canine transitional cell carcinoma[J]. Res Vet Sci， 2007，

83（2）：210-216.

[13] Fantappiè O， Solazzo M， Lasagna N， et al. P-glycoprotein me-

diates celecoxib-induced apoptosis in multiple drug-resistant cell

lines[J]. Cancer Res， 2007， 67（10）：4915-4923.

[14] Tegeder I， Pfeilschifter J， Geisslinger G. Cyclooxygenase-indepen-

dent actions of cyclooxygenase inhibitors[J]. FASEB J， 2001， 15

（12）：2057-2072.

[15] Chen C， Shen HL， Yang J， et al. Preventing chemoresistance of

human breast cancer cell line， MCF-7 with celecoxib[J]. J Cancer

Res Clin Oncol， 2011， 137（1）：9-17.

[16] Krishna S， Low IC， Pervaiz S. Regulation of mitochondrial meta-

bolism： Yet another facet in the biology of the oncoprotein Bcl-2

[J]. Biochem J， 2011， 435（3）：545-551.

[17] Zhou F， Yang Y， Xing D. Bcl-2 and Bcl-XL play important roles

in the crosstalk between autophagy and apoptosis[J]. FEBS J， 2011，

278（3）：403-413.

（本文編輯 李彩）