寧夏回漢族人群Wnt3基因單核苷酸多態性與非綜合征型唇腭裂相關性的研究

信燕華 馬麗娟 翟堃等

[摘要] 目的 探討寧夏回漢族人群中Wnt3基因rs142167和rs7216231位點單核苷酸多態性（SNP）與非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）的相關性。方法 收集寧夏地區回漢族人群非綜合征型唇腭裂患者371例為病例組，其中漢族患者

166例，回族患者205例；收集患者父親196例，患者母親224例，其中150例患者為NSCL/P核心家系；258例健康新生兒為對照組，其中漢族190例，回族68例。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）方法檢測Wnt3基因多態位點rs142167和rs7216231基因型，對比分析2組的基因型和等位基因，并進行傳遞不平衡檢驗（TDT）和以家系為基礎的相關性檢驗（FBAT）分析。結果 回漢族人群病例組與對照組比較及其民族分層比較，唇裂、腭裂、唇腭裂及總病例組rs142167和rs7216231位點均無統計學差異（P>0.05）。TDT分析結果顯示：rs142167和rs7216231位點的等位基因均不存在過傳遞（P>0.05）。FBAT分析結果顯示：單倍型G-G具有統計學意義（P<0.05）。結論 Wnt3基因多態性與寧夏地區回漢族人群非綜合征型唇腭裂不存在相關性。

[關鍵詞] 非綜合征型唇腭裂； Wnt3； 單核苷酸多態性

[中圖分類號] R 782.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.017

非綜合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with

or without cleft palate，NSCL/P）的病因較為復雜，

涉及環境與遺傳因素及其交互作用[1]。目前已有多

個可能相關的候選基因及環境因素，但不同地區甚至不同表型NSCL/P的候選基因有很大差異，研究結果重復性差[2-3]。Wnt家族參與生物體內廣泛的生物學效應，影響著生物體的生長發育。2008年Chiquet等[4]報道了Wnt家族的Wnt3基因多態性與NSCL/P有相關性。2010年Menezes等[5]也發現Wnt3基因多態性與

NSCL/P有顯著相關性。目前，Wnt3基因多態性與NSCL/P的相關性尚未得到廣泛的支持及驗證，國內也無關于Wnt3基因與NSCL/P相關性的研究報道。本研究選擇人口流動性不大、遺傳較為穩定的寧夏地區人群為研究對象，以揭示中國寧夏地區回漢族人群中Wnt3基因單核苷酸多態性（single nucleotide po-

lymorphism，SNP）與NSCL/P是否存在相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集寧夏地區回漢族人群的SNP患者371例為病例組，其中漢族患者166例，回族患者205例，要求患者家庭至少三代為寧夏籍貫，并且排除其他先天性畸形及綜合征型唇腭裂。收集患者父親196例，患者母親224例，其中150例患者為NSCL/P核心家系。

收集同期在寧夏醫科大學總醫院出生的258例健康新生兒為對照組，其中漢族190例，回族68例，要求家庭至少三代為寧夏籍貫。

1.2 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（polyme-

rase chain reaction-restriction fragment length

polymorphisms，PCR-RFLP）檢測

采集外周血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，提取基因組DNA，進行PCR擴增。應用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計引物和內切酶（表1）。PCR反應體系：待測DNA模板50～100 μg、MasterMix 12.5 μL。上下游引物各2 μmol·L-1，用去離子水補足為25 μL。反應條件：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性30 s，rs142167 60 ℃及rs7216231 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環。PCR產物酶切：取PCR擴增產物5 μL，加Cf rⅠ限制性內切酶和NmuC Ⅰ1 U及相應的10×buffer 1 μL，37 ℃水浴酶切12～16 h。電泳分析酶切產物，取10 μL酶切產物上樣，在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察結果，確定個體的基因型。隨機挑選10%的標本進行直接測序。

1.3 統計分析

對患者及其父母和對照組的基因型分布進行Hardy-Weinberg（HW）平衡檢驗。采用PASW statis-tics 18軟件對患者與對照組的基因型和等位基因進行分析，采用傳遞不平衡檢驗（transmission disequi-

librium test，TDT）以及以家系為基礎的相關性檢驗

（family based association test，FBAT）分析Wnt3的

rs142167和rs7216231多態位點與NSCL/P的相關性，并進行2個位點間組合的單倍型分析。FBAT參數設定為基因型模型、雙等位遺傳模型。依據民族不同，將病例組與對照組人群又分為漢族和回族，進行rs142167、rs7216231基因型及等位基因的比較。

2 結果

2.1 基因分型

rs142167和rs7216231多態位點的酶切電泳分型結果見圖1、2。酶切后分型的結果與測序的結果完全一致。

M：DNA marker；1、3、7：雜合子AG；2、4、5：純合子GG；6：純合子：AA。

2.2 HW平衡檢驗

HW平衡檢驗表明：患者及其父母和對照組的基因頻率分布均符合HW平衡，且無統計學差異（P>0.05）。

2.3 2組的基因型和等位基因分析

rs142167位點和rs7216231位點基因型、等位基因頻率在患者組及對照組的分布和比較見表2～4。與對照組相比較，唇裂、腭裂、唇腭裂以及總病例組的rs142167（P=0.33，P=0.51，P=0.61，P=0.50）和

rs7216231（P=0.35，P=0.15，P=0.29，P=0.25）位點均無統計學差異。與對照組漢族人比較，唇裂組、腭裂組、唇腭裂組及總病例組漢族人的rs142167（P=0.98，P=0.31，P=0.69，P=0.72）和rs7216231（P=1.10，P=0.24，P=0.62，P=0.75）位點均無統計學差異。

與對照組回族人比較，唇裂組、腭裂組、唇腭裂組及總病例組回族人的rs142167（P=0.25，P=0.99，P=0.76，P=0.89）和rs7216231（P=0.19，P=0.56，P=

0.63，P=0.45）位點均無統計學差異。

2.4 TDT分析

TDT分析結果（表5）顯示：rs142167和rs7216231位點的等位基因均不存在過傳遞（P>0.05）。

2.5 FBAT分析

FBAT分析結果（表6）表明：單倍型G-G具有統計學意義（P<0.05），是NSCL/P的保護性單倍型，其他3種單倍型均無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

NSCL/P是一類多基因遺傳病，病因較復雜，具有顯著的遺傳異質性，并且受環境因素影響。Wnt家族基因散在分布于各條染色體中，在進化中高度保守，編碼一類富含半胱氨酸的分泌蛋白，在胚胎的原腸胚及中胚葉的形成過程中起重要的作用，調節腫瘤細胞和干細胞的增殖、分化和存活[6]，并涉

及組織器官生長發育的多個方面。Niemann等[7]在對tetra-amelic綜合征的研究中發現，Wnt3基因的純合無義突變可使患者的四肢闕如、泌尿生殖系統發育障礙并伴有唇裂。Chiquet等[4]2008年報道在人類唇

腭裂病例中發現了Wnt基因編碼區及非編碼區的多個突變與之相關，并報道了Wnt3在內的7個Wnt基因的38個單核苷酸多態性位點和NSCL/P相關性的研究。其研究結果顯示：Wnt3與美國人群和西班牙人群NSCL/P具有顯著相關性。Menezes等[5]在高加索人群中也發現Wnt3與NSCL/P有顯著相關性。本文探討了Wnt3的SNP多態位點與中國寧夏回漢族人群NSCL/P之間的相關性。

本研究病例組Wnt3的rs142167位點的A等位基因頻率為34%，G等位基因頻率為66%，與HapMap數據庫中北京漢族人群A等位基因頻率36%和G等位基因頻率64%基本一致。Menezes等[5]報道rs142167

與非綜合征型唇腭裂具有顯著相關性。而本研究中rs142167在各組之間無統計學差異（P>0.05），提示

SNP rs142167與寧夏地區回漢族人群NSCL/P不相關。rs7216231位點的A等位基因頻率為65%，G等位基因頻率為35%，與HapMap數據庫中北京漢族人群A等位基因頻率64.8%和G等位基因頻率35.2%也基本一致。同時本研究結果也提示rs7216231與寧夏地區回漢族人群NSCL/P不相關。這與其他學者[4-5]的研究結果不一致，這種差異的產生可能與遺傳異質性及種族差異性有關。單倍型G-G（rs142167-rs7216231位

點組成的單倍型）具有統計學意義（P<0.05），G-G是NSCL/P的保護性單倍型（Z=-2.180），這一結果可能是

由于單個等位基因不是造成NSCL/P的因素或保護因素，但當兩個等位基因疊加或者多個等位基因疊加就會增加NSCL/P的患病概率或者保護概率。

NSCL/P被公認為是一種由多個微效基因與環境因素共同作用所致的復雜疾病，具有明顯的遺傳異質性、表型復雜性及種族差異性。本實驗結果在一定程度上反映了NSCL/P存在種族差異性及遺傳異質性，但不能排除環境因素的影響，今后尚需進一步增加對Wnt3的其他SNP位點的研究，并納入環境因素一起來探討其對NSCL/P發病的影響。

[參考文獻]

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[4] Chiquet BT， Blanton SH， Burt A， et al. Variation in WNT genes

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（本文編輯 李彩）