壓應力對小鼠單核細胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12、抗酒石酸酸性磷酸酶表達的影響

黃生高 凌天牖 鐘孝歡等

[摘要] 目的 探討壓應力對小鼠單核細胞RAW264.7 DNAX活化蛋白12（DAP12）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）表

達的影響。方法 以小鼠單核細胞RAW264.7為研究對象，采用四點彎曲體外細胞加載裝置加載壓應力0、3、6、12 h，分別以逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、蛋白免疫印跡法檢測DAP12、TRAP mRNA和DAP12蛋白的表達情況。結果

小鼠單核細胞RAW264.7經破骨細胞培養液培養后，體積變大，核數目增多，TRAP染色陽性。受壓應力刺激后，DAP12、TRAP mRNA及DAP12蛋白表達隨加力時間延長而增加（P<0.05）。結論 小鼠單核細胞RAW264.7經破骨細胞培養液培養后成功向破骨細胞轉化，轉化細胞受壓應力刺激活化過程中存在DAP12高表達。

[關鍵詞] DNAX活化蛋白12； 抗酒石酸酸性磷酸酶； 壓應力； 破骨細胞

[中圖分類號] Q 78 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.008

破骨細胞由其前體細胞分化而來，在其分化并行使功能的過程中受多條信號傳導通路調控。其中免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）信號傳導通路日益受到人們的重視。已知DNAX活化蛋白12（DNAX-activa-ting protein 12，DAP12）是骨髓來源細胞系ITAM的主要銜接蛋白，在ITAM信號通路中起著樞紐作用。但其在破骨細胞受機械力刺激后的表達及作用尚不清楚。本實驗擬探討在小鼠單核細胞株RAW264.7受壓應力的刺激后，DAP12、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA及DAP12蛋白的表達情況，為進一步研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠單核細胞株RAW264.7（ATCC公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），兔抗人

DAP12多克隆抗體、羊抗人β-actin多克隆抗體、辣根過氧化酶HRP標記的兔抗羊IgG（Santa Cruz公司，

美國），小鼠重組可溶性核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，

RANKL）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage co-

lony-stimulating factor，M-CSF）（Peprotech公司，美國），TRIzol、逆轉錄試劑盒、TaKaRa TaqTM PCR

試劑套裝、高糖DMEM培養基（Invitrogen公司，美

國），TRAP染色試劑盒（Sigma公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司，美國），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（Millipore公司，美國）等。

1.2 主要設備

SFEG AIR超凈工作臺（蘇州蘇凈公司），四點

彎曲體外細胞加載裝置（四川大學設計，專利號：

zL01256849.x），Forma Scientific CO2培養箱（Shellab公司，美國），Olympus IX50相差倒置顯微鏡（Oly-mpus公司，日本），Nikon YS100光學顯微鏡（Nikon公司，日本），DU530紫外分光光度計（Backman公

司，美國），PCR system 2700型PCR擴增儀（美國應用生物系統公司），DYY-Ⅱ、DYY-Ⅲ型凝膠電泳儀（北京六一儀器廠），GelDoc 2000凝膠成像系統

（Bio-Rad公司，美國）等。

1.3 細胞分組和加力

1.3.1 加力板的準備 將750 mL斜頸培養瓶從中間剖開，取細胞培養常用的底面，打磨成8.0 cm×3.0 cm大小的兩塊，周緣平滑四角圓鈍，以避免加力過程中的應力集中。使用清水洗凈加力板，放入酸性洗液中過夜后用三蒸水反復沖洗數次，再放入75%乙醇中浸泡24 h，三蒸水浸泡12 h后在56 ℃烘箱中烤干，最后在超凈工作臺紫外消毒燈下雙面照射滅菌（各12 h）后接種細胞。

1.3.2 加力前細胞的準備 將常規傳代后的RAW-264.7細胞以密度為每毫升1×104個接種于加力板上（實驗組和對照組同時種板）。加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱培養，1 d后細胞絕大部分貼壁，更換為破骨細胞培養液（DMEM全培養液含20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL），繼續培養6 d。

1.3.3 細胞加力 采用四點彎曲體外細胞加載裝置對接種在加力板上的RAW264.7細胞進行壓應力刺激。本實驗設實驗組與對照組，實驗組使用的壓應力頻率為0.5 Hz，大小為2 500 μtrain，在0、3、6、12 h不同時間段，使細胞在平行于貼壁方向上發生單軸壓縮應變；對照組不加力。對照組和實驗組各包含3個實驗樣本，每組的3個樣本均來自同一瓶計數的細胞，以相同的細胞密度和細胞量接種在加力板上。除加力時間與是否加力影響因素外，其他條件基本一致。加力結束后分別收獲細胞，進行后續相關實驗。

1.4 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcrip-

tion-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測

DAP12、TRAP mRNA的表達

1.4.1 細胞總RNA的提取及純度測定 按照TRIzol試劑盒說明提取細胞總RNA。

1.4.2 逆轉錄生成cDNA第一鏈 取1 μg總RNA，按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄，生成20 μL cDNA第一鏈。

1.4.3 PCR擴增 實驗引物序列具體如下。DAP12上游引物序列：5-GGCTGGGATTGTTCTGGGTGAC-3，下游引物序列：5-CCGCTGATGGGCATAGAG-TGG-3。TRAP上游引物序列：5-ACACAGTGAT-GCTGTGTGGCAACTC-3，下游引物序列：5-CC-AGAGGCTTCCACATATATGATGG-3。GAPDH上游引物序列：5-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3，下游引物序列：5-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3。

按照TaKaRa TaqTM PCR試劑盒說明生成20 μL PCR產物。PCR擴增條件如下。DAP12：94 ℃預變性5 min，開始循環94 ℃ 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共35個循環，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。TRAP：94 ℃預變性5 min，開始循環94 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共35個循環，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。GAPDH：95 ℃預變性

5 min，開始循環95 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環，72 ℃徹底延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.4 PCR產物凝膠電泳 各取20 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（電壓100 V），凝膠成像系

統照相并用Quantity one-4.0.3凝膠圖像分析軟件測量其積分光密度值（integral optical density value，

IOD）。分別計算DAP12 mRNA、TRAP mRNA與GAPDH mRNA RT-PCR產物電泳帶IOD值之比。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測DAP12蛋白的表達

首先應根據欲分離的蛋白質相對分子質量大小選擇適合的凝膠濃度。本研究分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%。常規提取蛋白質，并測定濃度。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行分析。實驗結果以mean±SD表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠單核細胞RAW264.7的培養及其向破骨細

胞分化

體外培養的小鼠單核細胞RAW264.7在10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中生長良好。以密度為每毫升1×104個進行接種，2～12 h細胞貼壁，5～6 d細胞長滿培養瓶。倒置顯微鏡下可見培養瓶培養的貼壁RAW264.7細胞大多數呈類圓形，少量細胞呈不規則形態，有偽足，一般含1～2個細胞核（圖1）。加入破骨細胞培養液培養4 d后，可見多核細胞，胞內有3～7個核，細胞大小不一，形態各異，TRAP染色陽性；培養第7天，TRAP染色陽性多核細胞增多，體積增大，核數目增多，表明RAW264.7細胞向破骨細胞轉化（圖2）。

2.2 力刺激對RAW264.7細胞DAP12、TRAP mRNA

表達的影響

2.2.1 RNA純度和電泳結果 采用紫外分光光度計測量RNA的純度，A260 nm/A280 nm比值均在1.7～2.0，顯示RNA的純度較高。瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5S 3條帶，無明顯雜帶（圖3）。

2.2.2 PCR產物電泳結果 受壓應力刺激后，實驗組DAP12、TRAP mRNA表達隨加力時間延長而逐漸增加，對照組無明顯變化（圖4）。隨著壓應力刺

激時間的延長，RAW264.7細胞DAP12 mRNA表達逐漸增加，3 h時增加不明顯，6 h后開始顯著增加。實驗組加力6、12 h與加力0 h比較，差異有統計學意義（P<0.05）；加力6、12 h，實驗組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）。刺激3 h后TRAP mRNA表達雖然輕微上調，但無顯著差別，隨著壓應力刺激時間的延長，TRAP mRNA表達逐漸升高（6、12 h）。實驗組加力6、12 h與0 h比較，差異有統計學意義（P<0.05），加力6、12 h，實驗組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（圖6）。

2.3 壓應力刺激對RAW264.7細胞DAP12蛋白表達

的影響

壓應力刺激RAW264.7細胞3 h后，DAP12蛋白表達水平增加并不明顯，隨著壓應力刺激時間的延長（6、12 h），DAP12蛋白表達水平逐漸增高。實驗組加力6、12 h與0 h比較，差異有統計學意義（P<

0.05），加力6、12 h，實驗組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（圖7、8）。

3 討論

3.1 細胞和應力加載裝置的選擇

體外培養原代的破骨細胞難度很大，成功率較低。小鼠單核細胞RAW264.7在適宜濃度的破骨細胞培養液作用下，可分化成多核的、TRAP染色陽性的、具有骨吸收功能的破骨細胞。重復性好，結果穩定[1-2]。本實驗參考國內外學者的培養經驗，采用20 ng·mL-1的M-CSF和50 ng·mL-1的RANKL聯合培養RAW264.7細胞，可誘導其向破骨細胞分化，能較好地滿足實驗對細胞量要求較大，且細胞貼壁良好，符合實驗中需加力的要求。

人體日常活動引起骨骼細胞的應變約為400～

2 000 μstrain，而在劇烈活動時細胞的應變約為

4 000 μstrain[3]。本實驗采用2 500 μstrain的應變符合體內細胞的生理應變范圍。除了應變大小之外，機械外力刺激的頻率也可對骨骼細胞產生影響[4-5]，本實驗采用0.5 Hz頻率的壓應力可盡量的減少加力過程中培養液對細胞產生的流體剪切力[2]。四點彎曲細胞力學加載儀采用梁變形原理，利用數控步進電機使細胞培養板發生應變，使貼附在培養板上的細胞產生形變，從而間接地對細胞產生精確、恒定的單軸應力?？蓾M足多種應變需求，是一種可靠且重復性較高的細胞體外力學加載儀。而且該裝置是通過細胞加力板細胞培養面面積的改變而對其表面培養的細胞進行擠壓，故與其他一些加力裝置相比更能模擬體內壓力側牙槽骨破骨細胞的受力情況。

3.2 壓應力刺激對破骨細胞分化的影響

TRAP是破骨細胞特有的標志酶，是破骨細胞分化的標記物，也與破骨細胞骨吸收功能密切相關[6-7]。

檢測TRAP的表達情況可反映RAW264.7細胞的功能狀態。

本研究發現：在RANKL和M-CSF聯合作用下，壓應力刺激可提高RAW264.7的破骨細胞特征，而對照組這種變化并不明顯。機械外力的這種誘導能力與其對細胞刺激的時間長短有關，刺激時間過短，并不能引起破骨細胞的高度活化，只有機械外力刺激一定的時間后破骨細胞的活化才變得更加明顯。這與臨床上正畸牙的移動情況有些相似，短暫的力學刺激（咬合力或短暫的正畸力等）作用于牙齒并不能引起牙齒的移動，只有持續的正畸力才能引起牙齒移動。

3.3 壓應力刺激對RAW264.7細胞DAP12 mRNA和

蛋白表達的變化

破骨細胞來源于骨髓造血系統的單核細胞系，破骨細胞的分化與成骨細胞密切相關。成骨細胞可表達RANKL，通過細胞間接觸與破骨前體細胞胞膜上的RANK受體結合，激活RANK介導的信號傳導通路來誘導破骨前體細胞向破骨細胞分化[8]。近年來

的研究表明破骨細胞的分化除了要激活與RANKL和 M-CSF相對應的細胞膜受體及相對應的細胞內信號通路外，還需要其他的信號通路參與調節[9-10]。ITAM

信號傳導通路在骨代謝平衡或病理性骨改建（像炎

癥性骨吸收等）過程中起重要調節作用。DAP12作為ITAM信號傳導通路的一種主要銜接蛋白，其介導的信號傳導通路在破骨細胞分化過程中發揮重要作用。正畸牙移動是個炎癥反應過程[11]，這可能引起局部

的免疫反應。DAP12介導的信號傳導通路作為在炎癥性骨吸收過程中發揮重要作用的信號通路是否也參與調節正畸移動過程中牙槽骨的改建和調節機械力誘導破骨細胞分化，目前尚未清楚。

本研究發現壓應力在刺激RAW264.7細胞后，DAP12 mRNA表達隨著壓應力刺激時間的延長逐漸增加。表明DAP12可能參與了破骨細胞對機械力刺激的應答反應。如前所述，2 500 μtrain的壓應力隨著作用時間的增加可逐步上調破骨細胞分化標記物TRAP mRNA的表達，這與DAP12 mRNA表達的趨勢類似，故筆者推測DAP12可能參與調節機械壓應力誘導RAW264.7細胞的破骨細胞表征的過程。mRNA是從轉錄水平進行研究，它并不能完全體現蛋白質的表達水平。蛋白質是生理功能的執行者，對蛋白質的研究更能闡明各種生理或病理條件下生命現象的變化機制。本實驗發現在受到壓應力刺激3 h后，DAP12蛋白表達水平增加并不明顯；隨著壓應力刺激時間的延長（6、12 h），DAP12蛋白表達水平逐漸增高。這與mRNA的變化基本相似。綜上所述，受到壓應力刺激后，RAW264.7細胞DAP12 mRNA和蛋白表達發生改變，提示DAP12參與調節機械力學刺激誘導破骨細胞的分化。

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（本文編輯 杜冰）