光激化學發光法定量測定AFP和CEA的性能評價

榮 揚，趙強元， 劉 敏，齊永志， 王珍光，李 娜

(海軍總醫院檢驗科，北京 100048)

縱觀標記免疫分析的發展史，近年來，化學發光免疫分析已占據了免疫分析的主導地位，尤其是進口的化學發光試劑占據了相當的份額。光激化學發光免疫分析技術(light initiated chemiluminescence assay，LiCA)[1]作為一種新型的國產化學發光免疫分析技術，與進口的酶促化學發光免疫分析技術在定量檢測結果上是否具有可比性，是目前需要探究的問題。

甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)[2]是臨床常用腫瘤標志物。AFP由Abelev等于1963年發現，是一種胚胎蛋白[3-4]，在肝癌、胚胎細胞腫瘤、卵巢癌或睪丸癌患者血清中會明顯升高。CEA于1965年由Gold和Freedmen從結腸癌患者血清中發現，在腫瘤生長和轉移[5]中起重要作用;在非小細胞肺癌[6]、結腸癌、直腸癌及內胚層來源的其他腫瘤癌變時會明顯升高。

我們評價了LiCA AFP、CEA定量檢測的分析性能，并與酶促化學發光法檢測試劑作了比較，以探討前者的方法優勢和臨床適用性。

材料和方法

一、材料

1.儀器與試劑 LiCA HT和SP化學發光免疫分析儀[博陽生物科技(上海)有限公司]及配套試劑(AFP、CEA試劑批號分別為 A1010、A1016)。BECKMAN-COULTER DXi800化學發光免疫分析儀(酶促化學發光法，美國 Beckman-Coulter公司)及配套試劑(AFP和CEA試劑批號分別為16688、195018)。

2.樣本 取自中國人民解放軍海軍總醫院臨床血清樣本，其中用于 AFP測定406例，用于CEA測定442例。

二、方法

1.分析靈敏度 評價方法參考美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)EP17-A[6]文件。在質控在控的情況下，同批LiCA AFP/CEA試劑一次運行零值校準品20次，計算均值()及標準差(s)，以空白+2s來計算方法的分析靈敏度。

2.批內精密度 參考 NCCLS EP5-A2[7]文件程序。采用同一批試劑、校準品以各自配套的2個水平質控血清作為測試標本，一次運行對標本重復測定20次，計算、s及變異系數(CV)，此為批內不精密度。相同質控品檢測20 d，計算、s及CV，此為批間精密度。免疫定量精密度要求范圍批內CV≤10%，批間CV≤15%。

3.線性 參考 NCCLS EP6-A[8]文件，選用已知高、低濃度2個樣本等比例稀釋成6個濃度水平，每個濃度測定6次，剔出離群點，計算。以測定值為X軸、理論值為Y軸作圖，進行線性回歸。斜率(b)在0.97～1.02時為可用線性范圍，否則縮小線性范圍直至b符合要求。

4.相關性分析 在質控在控的情況下，分別采用LiCA和酶促化學發光法同時檢測AFP和CEA并做相關分析。

三、統計學方法

采用SPSS11.5軟件對2種系統的AFP、CEA定量相關系數(r)進行統計學分析。

結 果

一、分析靈敏度

依據零值校準品測定值計算所得，LiCA AFP和CEA 的分析靈敏度分別為0.112、0.05 ng/mL。

二、精密度

見表1。

表1 LiCA檢測AFP和CEA的精密度 (%)

三、線性

LiCA測定AFP和CEA的線性數據見表2。對表2數據做回歸分析，得出方程:YAFP=0.99 XAFP+1.36，r=0.999;YCEA=0.98XCEA+2.87，r=0.999。AFP 線性范圍為2.6 ～950.2 ng/mL，CEA線性范圍為1.2 ～862.6 ng/mL。

表2 LiCA測定AFP和CEA的線性數據 (ng/mL)

四、相關性分析

以酶促化學發光法結果為基準，對406例AFP血清樣本及442例CEA血清樣本分別做定量相關分析，相關方程分別為YAFP=1.027XAFP－0.516，r=0.997;YCEA=0.821XCEA+1.355，r=0.991，見圖 1、2。

圖1 LiCA和酶促化學發光法AFP定量結果相關性

圖2 LiCA和酶促化學發光法CEA定量結果相關性

討 論

1959年美國學者Berson和Yalow用放射免疫法成功測定了血漿胰島素[10]，開創了標記免疫分析的新紀元。接著，各種新型的標記物的不斷推出，使得標記免疫分析有了突飛猛進的發展:從放射免疫發展到無放射性污染的酶聯免疫，再到靈敏度更高的熒光免疫，最后到易于自動化的發光免疫。化學發光免疫分析是上世紀90年代出現的標記免疫分析，根據其標記物的不同又分為直接化學發光、酶促化學發光、電化學發光和光激化學發光。

酶促化學發光[11]主要包括堿性磷酸酶(AP)系統、辣根過氧化物酶(HRP)系統等。美國Beckman-Coulter公司是AP系統的代表，其原理是采用磁性微粒為固相載體包被抗原或抗體，AP標記抗原或抗體，利用免疫反應使得AP同待測物結合到固相載體上，通過磁場分離、洗滌后加入底物金剛烷二氧環已烷(AMPPD)，數分鐘后測定發光強度來測定待測物的濃度。

光激化學發光作為一種新的化學發光免疫分析技術，是繼單線態氧分子能量傳遞發光免疫分析 技 術[12](luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)技術問世之后，在國內建立、發展并應用于臨床檢測的一種新型檢測技術。其檢測原理是以填充了感光和發光染料的2種200 nm的高分子納米微球為載體分別共價交聯抗原抗體，由免疫反應拉近感光和發光微球的距離至200 nm以內。當用680 nm激發光照射，感光染料被激活并釋放高能態的單線態氧給發光染料，4 μs后發光微粒發出610 nm的光，根據光信號得到待檢物的濃度，簡而言之就是“結合則發光”。該方法屬于均相免疫反應，相對于非均相免疫分析其實施難度更大，技術含量更高。

均相免疫反應是在抗原抗體反應過程中不需要清洗分離而在反應結束后直接測量信號的免疫分析方法。而在免疫分析中，清洗分離這一步驟所產生的誤差占免疫分析總誤差的70%～80%，如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等進行定量分析由于包被不均一性和清洗分離的不確定性，導致其不精密度和準確性不夠理想。光激化學發光免疫分析技術因具有免清洗分離的特點，減少了清洗和分離所帶來的誤差，減少了反應時間，并且易于實現自動化和高通量檢測[13]。因此，可以說LiCA技術是標記免疫技術發展進程中一個新的生力軍。作為非均相免疫分析的代表之一，美國Beckman-Coulter公司的全自動化學發光因其先進的工藝使其分析過程的誤差降到了很低的水平。而光激化學發光利用其免清洗技術實現了分析性能的可靠。

本研究對LiCA AFP和CEA定量檢測試劑的臨床性能做了評估，結果顯示LiCA測定AFP和CEA在分析靈敏度、線性和精密度方面均可滿足臨床應用;與酶促化學發光法結果進行比對，2種檢測系統高度相關(r＞0.99)。由此可見LiCA檢測AFP和CEA的分析性能可以滿足符合相關標準要求;且具有均相免清洗、試劑成本較低等優點，因此能夠應用于臨床，滿足廣大臨床實驗室和患者的需求。

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