TNF-α對卵泡內膜細胞睪酮分泌及細胞增殖的影響

洪 嶺，張云香，陳信良

(1.同濟大學附屬第一婦嬰保健院生殖醫學中心，上海 200040;2.山東省濰坊市人民醫院病理科，山東 濰坊 261041;3.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院婦科，上海 200030)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以性腺軸失調為主的一個復雜的全身性神經-內分泌-代謝網絡失控的癥候群，其發病機制至今不是十分清楚。目前認為PCOS的發病機制與以下因素有關:腎上腺功能初現亢進、下丘腦神經內分泌功能異常、胰島素樣生長因子異常、胰島素抵抗、遺傳因素等，但任何單一學說都難以全面解釋PCOS的所有臨床表現和生化、病理改變，PCOS已成為當今婦科內分泌領域的一個研究熱點和最復雜難點。近幾年，國內外許多文獻報道PCOS患者體內的許多炎癥因子，如腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、C 反應蛋白(CRP)、白細胞介素 6(IL-6)等水平高于正常人群，PCOS的發生、發展與炎癥因子具有密切關系[1-12]。PCOS類似糖尿病、動脈粥樣硬化等，可能也是一種炎癥性疾病。這里的炎癥不同于有紅、腫、熱、痛、發熱等表現的急性炎癥，而是由人體免疫系統介導的一種慢性、低度的非特異性的亞臨床炎癥狀態或促炎癥狀態(proinflammatory state)，患者體內的許多炎癥因子水平高于正常人群。有學者指出這種慢性，低度亞臨床炎癥(炎癥學說)可能也是PCOS的發病機制之一。那么炎癥因子引發PCOS的機制是什么?本研究將通過體外培養的卵泡內膜細胞進一步探討TNF-α與PCOS發病機制的關系。

材料和方法

一、試劑與儀器

豬重組 TNF-α(prospec)，DMEM/F12(1∶1)培養液(Hyclone)，膠原酶Ⅱ(TBD)，透明質酸酶(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，胎牛血清 (FBS，杭州四季青)，CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，36%乙酸溶液(上海化學試劑公司)，睪酮放射免疫測定試劑盒(北京北方生物技術研究所)。CO2細胞培養箱(HEPA CLASS 100)，倒置熒光顯微鏡(TE2000-U，Nikon Eclipse)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)，γ放射免疫計數器(Gc-911，安徽合肥中國科大中佳公司)。

二、原代豬卵泡內膜細胞的分離和培養

取新鮮的豬卵巢，置于放有雙抗的冰生理鹽水中(青霉素、鏈霉素各含80萬IU/500 mL生理鹽水)，冰盒內保存，于2 h內進行試驗。試驗時用生理鹽水反復沖洗，將卵巢放入平皿中，選取直徑約4～6 mm的健康卵泡，在解剖顯微鏡下用顯微解剖剪小心將卵泡對半剪開，使草黃色卵泡液流出，用自制刮匙仔細刮除附著在其表面的顆粒細胞，用顯微鑷剝離出卵泡內膜(呈帽狀)，并用生理鹽水反復沖洗數次。將卵泡內膜剪碎，加入酶液[0.25% 膠原酶Ⅱ、0.05% 透明質酸酶、0.05%胰蛋白酶]，置于37℃含5%CO2的培養箱內消化20～50 min，期間每隔10 min用移液管反復吹打以利于卵泡內膜的消化，以適量含血清的培養基終止消化后，以100目不銹鋼濾網濾過。以200×g離心5 min，除去酶，生理鹽水洗1次。將獲取的卵泡內膜細胞懸浮于含10%FBS的DMEM/F12培養基(含1%雙抗)內，0.04%臺盼蘭染色顯示活力(＞70%)，待用。

三、卵泡內膜細胞上清液睪酮濃度的測定

采用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)測定24孔培養板中細胞上清液的睪酮濃度，按照試劑盒說明書，依次加入標準品和樣品50 μL、125I標記的睪酮100μL及睪酮抗體100 μL，充分混合;37℃孵育1 h;加入沉淀劑0.5 mL，室溫放置15 min，1200 ×g離心 15 min;棄去上清，瀝干試管，γ記數器檢測。

四、CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒的檢測原理

CFDA SE的全稱為Carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，分子式為 C29H19NO11，相對分子質量為 557.47，CAS號碼為 150347-59-4。CFDA SE可以通透細胞膜，進入細胞后可以被細胞內的酯酶(esterase)催化分解成羥基熒光素乙酰乙酸(CFSE)，CFSE可以偶發性地并不可逆地和細胞內蛋白的Lysine殘基或其他氨基發生結合反應，并標記這些蛋白。在加入熒光探針CFDA SE后大約24 h即可充分標記細胞。被CFDA SE標記的非分裂細胞的熒光非常穩定，穩定標記的時間可達數月。CFDA SE標記細胞的熒光非常均一，比以前使用的其他細胞示蹤熒光探針如PKH26的熒光更加均一，并且分裂后的子代細胞的熒光分配也更均勻。由于CFDA SE標記細胞的熒光非常均勻和穩定，每分裂1次，子代細胞的熒光會減弱一半，這樣通過流式細胞儀檢測就可以檢測出沒有分裂的細胞、分裂1次的細胞(1/2的熒光強度)、分裂2次的細胞(1/4的熒光強度)、分裂3次的細胞(1/8的熒光強度)以及類似的其他分裂次數的細胞。使用CFDA SE可以檢測分裂多達8次或更多次數的細胞增殖。

CFDA SE標記細胞后通常用流式細胞儀進行細胞增殖檢測，CFDA SE標記細胞呈綠色熒光，檢測時的激發波長可以選擇488 nm，此時的發射波長為518 nm，使用流式細胞儀檢測時可以采用FL1 detection channel。CFDA SE標記的細胞也可以用熒光顯微鏡進行觀察。CFDA SE標記的細胞無論在體外還是體內都不會使鄰近細胞染色。即CFDA SE熒光探針完成標記后不會從一個細胞轉移到鄰近細胞。

五、豬原代卵泡內膜細胞CFDA SE的標記及培養

將豬卵泡內膜細胞按照CFDA檢測試劑盒的說明書完成CFDA標記，用DMEM/F12培養液稀釋成1×105/mL細胞懸液，按每孔1 mL加入到24孔培養板中，加入TNF-α，使其終濃度分別為0、10、100 和 1000 pg/mL，0 pg/mL 為對照組，每種濃度梯度均做3復孔。置37℃ 5%CO2培養箱培養48 h后換液，換液72 h后用流式細胞儀檢測細胞增殖情況。

六、流式細胞儀檢測卵泡內膜細胞增殖情況

常規胰酶消化、DMEM/F12培養液中和胰酶后，從24孔培養板中將每組細胞轉移到流式管中，200×g離心5 min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)再洗滌1次，用PBS稀釋到適宜濃度后上機檢測。

流式細胞儀(BD FACSCalibur)檢測:光源488 nm的氫離子激光，上機前先用標準微球調整儀器，使變異系數在2%以內，上機后收集10000個細胞，熒光強度以對數放大，光散射數據存硬盤，用 FlowJo軟件分析每組細胞的平均熒光強度。

七、統計學方法

所有數據采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、TNF-α對豬卵泡內膜細胞睪酮分泌的影響

TNF-α濃度為 10、100和 1000 pg/mL 3個試驗組，在24、48和72 h 3個時間點分別與空白對照組(不加藥組，TNF-α濃度0 pg/mL)相比，每個濃度做3復孔，重復3次。結果顯示，在加入 TNF-α 后，24、48和 72 h 3個時間點分別與空白對照組比較，睪酮水平未見明顯變化，見表1。

表1 TNF-α刺激下卵泡內膜細胞所分泌的睪酮與對照組的比較 (ng/mL)

二、TNF-α對豬卵泡內膜細胞增殖情況的影響

在TNF-α (100和1000 pg/mL)刺激72 h后，卵泡內膜細胞的平均熒光強度(MFI)與空白對照組(TNF-α 0 pg/mL)相比明顯降低(分別為53.2 ±11.59和66.87 ±14.8，P=0.013;47.55 ±7.31 和 66.87 ± 14.8，P=0.001);而 TNF-α(10 pg/mL)與空白對照組(TNF-α 0 pg/mL)相比，沒有出現明顯變化(60.2 ±9.20和 66.87 ±14.8，P=0.211)。

討 論

1985年Shalaby把巨噬細胞產生的TNF命名為TNF-α，把 T淋巴細胞產生的淋巴毒素(lymphotoxin，LT)命名為 TNF-β，兩者生物學作用極為相似。人的TNF-α基因長約2.76 kb，相對分子質量為17000。TNF-α來源包括各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞和平滑肌細胞等，其中活化的單核巨噬細胞是其主要來源。TNF-α具有廣泛的生物學活性，如殺傷或抑制腫瘤細胞;提高中性粒細胞的吞噬能力，增強抗體依賴細胞介導的細胞毒反應(ADCC)功能;抗感染;引起發熱，并誘導肝細胞急性期蛋白的合成;抑制病毒的復制;在調節機體組織糖、脂肪代謝中也起重要作用。

楊雪峰等[13]報道無論是PCOS伴肥胖組，還是體重正常PCOS組血漿TNF-α水平均高于正常對照人群。Peral等[14]報道，腫瘤壞死因子受體Ⅱ基因(the tumour necrosis factor receptor superfamily 1B gene，TNFRSF1B)與 PCOS 發病有關。第6外顯子部位的M196R(676T→G)變異與其第4內含子CA微衛星重復多態性呈連鎖不平衡，M196R出現頻率在PCOS組(30.3%)和對照組(15.3%)婦女中比較，差異有統計學意義(P＜0.05);該結果顯示，TNFRSF1B第 6外顯子M196R多態性與PCOS和高雄激素血癥密切相關。

典型的PCOS卵巢組織形態學上會發生如下變化:卵巢雙側硬化性多囊改變，卵巢被膜呈纖維化或膠原化增厚，表面飽滿、光滑，呈珍珠白色，體積較正常卵巢增大2～3倍，切面可見卵巢的白膜均勻增厚，皮質區增寬，被膜下有多個直徑2～9 mm囊狀卵泡或較大儲留卵泡囊腫，罕見黃體或白體，卵巢的髓質區增厚，伴有水腫。鏡下顯示，卵巢的白膜組織呈彌漫性增厚，較正常厚3～4倍，均由膠原化的纖維組織所組成。白膜下有許多不同成熟階段的卵泡及閉鎖的卵泡存在，卵泡內顆粒細胞少而稀疏，卵泡膜細胞增生，卵巢間質有時黃素化，但卵泡無排卵跡象。

本研究發現，在體外培養的卵泡內膜細胞中加入炎癥因子TNF-α后，睪酮分泌沒有明顯變化，但卵泡內膜細胞的增殖能力卻加強，說明TNF-α具有促進卵泡內膜細胞增殖的作用，這個功能可能與PCOS患者發生卵巢白膜增厚、卵泡內膜細胞增生病變有關。TNF-α引起細胞增殖的機制與激活如Jun氨基末端激酶(JNK)等信號轉導通路有關[15];TNF-α 還可引起胰島素抵抗(IR)[2]，繼而由 IR 參與 PCOS的發生。

[1]曾玖芝，周豐寧，沈宗姬，等.白細胞介素18與多囊卵巢綜合征患者胰島素抵抗關系探討[J].中國婦幼保健，2008，23(9):1193-1195.

[2]Tarkun I，Cetinarslan B，Türemen E，et al.Association between circulating tumor necrosis factor-alpha，interleukin-6，and insulin resistance in normal-weight women with polycystic ovary syndrome[J].Metab Syndr Relat Disord，2006，4(2):122-128.

[3]Dumesic DA，Abbott DH，Padmanabhan V.Polycystic ovary syndrome and its developmental origins[J].Rev Endocr Metab Disord，2007，8(2):127-141.

[4]Radomski D，Orzechowska A，Barcz E.Present conceptions of etiopathogenesis of polycystic ovary syndrome[J].Ginekol Pol，2007，78(5):393-399.

[5]Escobar-Morreale HF，Calvo RM，Sancho J，et al.TNF-alpha and hyperandrogenism:a clinical，biochemical，and molecular genetic study[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86(8):3761-3767.

[6]Orio F，Vuolo L，Palomba S，et al.Metabolic and cardiovascular consequences of polycystic ovary syndrome[J].Minerva Ginecol，2008，60(1):39-51.

[7]Guzelmeric K，Alkan N，Pirimoglu M，et al.Chronic inflammation and elevated homocysteine levels are associated with increased body mass index in women with polycystic ovary syndrome[J]. Gynecol Endocrinol，2007，23(9):505-510.

[8]Benson S，Janssen OE，Hahn S，et al.Obesity，depression，and chronic low-grade inflammation in women with polycystic ovary syndrome[J].Brain Behav Immun，2008，22(2):177-184.

[9]Shroff R，Kerchner A，Maifeld M，et al.Young obese women with polycystic ovary syndrome have evidence of early coronary atherosclerosis[J]. J Clin Endocrinol Metab，2007，92(12):4609-4614.

[10]Moran LJ，Noakes M，Clifton PM，et al.C-reactive protein before and after weight loss in overweight women with and without polycystic ovary syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab，2007，92(8):2944-2951.

[11]Elks CM，Francis J.Central adiposity，systemic inflammation，and the metabolic syndrome[J].Curr Hypertens Rep，2010，12(2):99-104.

[12]余 帆.肥胖型多囊卵巢綜合征患者血清炎癥因子的變化及二甲雙胍干預效果的臨床研究[J].中國婦幼保健，2011，26(25):3878-3881.

[13]楊雪峰，任芬若，郭淑萍.多囊卵巢綜合征患者血清脂聯素水平與胰島素抵抗關系的研究[J].中華婦產科雜志，2006，41(4):261-263.

[14]Peral B，San Millán JL，Castello R，et al.Comment:the methionine 196 arginine polymorphism in exon 6 of the TNF receptor 2 gene(TNFRSF1B)is associated with the polycystic ovary syndrome and hyperandrogenism[J].J Clin Endocrinol Metab，2002，87(8):3977-3983.

[15]Korobowicz A.Biology of tumor necrosis factor type alpha(TNF-alpha)[J].Pol Merkur Lekarski，2006，21(124):358-361.