葡多酚對老齡大鼠抗氧化力及細胞增殖活性的影響

邱霞 姜永梅

葡多酚(grape procyanidins，GPC)是從新鮮葡萄籽中提取的一種天然植物多酚物質［1］。國內外研究證實，GPC具有清除自由基、抗氧化和提高細胞增殖活性等多種生物學功效［2-3］。本實驗采用GPC加入飼料喂養大鼠的方法，觀察GPC對老齡大鼠抗氧化能力及肝細胞增殖活性的影響。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組 自山東省魯抗醫藥實驗中心購清潔級健康雄性15月齡Wistar大鼠40只，體質量310～485 g，隨機分為空白對照組和GPC低、中、高劑量組，每組10只。于本實驗室適應性喂養1周后用于實驗。

1.2 飼料配制 葡多酚為本實驗室制備，含量＞99%，標準品由日本島田株式會社提供。大鼠飼料購自中科院實驗動物研究所。GPC低、中、高劑量組的飼料為每公斤普通飼料中分別加入10、100、200 mg的GPC。以上3組充分混勻后制成餅狀。

1.3 試劑與儀器 大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RPMI-1640培養基、胎牛血清、四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購自美國GLBCD BRL公司。自動酶標儀為瑞典產RosysAnthos 2010型。

1.4 實驗方法 空白對照組喂飼普通飼料，GPC低、中、高劑量組分別喂飼加入前述不同劑量GPC的普通飼料。各組動物均自由進食，喂養50 d后次日清晨處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清備檢GSH-Px、SOD和MDA。無菌條件下取出肝臟剪碎，制成單細胞懸液用以檢測細胞增殖活性。

1.5 檢測指標

1.5.1 抗氧化指標:取血清2 ml按說明書方法采用還原法測定GSH-Px活力，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.5.2 細胞增殖活性(MTT法):取制備好的肝細胞懸液，調節細胞密度為1×106/ml，接種于96孔培養板，每孔加0.1 ml細胞懸液，每個樣本設3個平行孔，置37℃，5%CO2培養箱內培養48 h，加入5 mg/ml MTT 液，10 μl/孔，繼續培養 4 h。每孔加入0.1 ml二甲亞楓(DMSO)，吹打溶解，在酶標儀上記錄492 nm波長溶液的吸光值(A值)。計算不同劑量的GPC對肝細胞增殖的促進率:促進率(%)=(GPC組 -空白對照組)/空白對照組×100%

1.6 統計方法 所有數據均使用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，結果采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結果

2.1 GSH-Px、SOD和MDA檢測結果 GPC中、高劑量組的SOD、GSH-Px和MDA與空白對照組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠GSH-Px、SOD和MDA檢測結果±s，n=10)

表1 各組大鼠GSH-Px、SOD和MDA檢測結果±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與GPC低劑量組比較，△P＜0.05

組別 GSH-Px(U/ml) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)空白對照組＊△1229.84±70.55 597.88±88.60 12.38±1.33 GPC低劑量組 1275.19±70.17 605.57±101.12 11.45±1.16 GPC中劑量組 1327.17±82.53* 658.95±12.30* 8.72±0.90*GPC高劑量組 1420.11±75.34＊△ 729.70±12.04＊△ 6.40±1.25

2.2 肝細胞增殖活性檢測結果 GPC中、高劑量組的A值分別為1.18±0.13、1.29±0.10，均較空白對照組的增殖活性明顯升高(P＜0.05);GPC高劑量組細胞增殖促進率高于GPC低劑量組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝細胞增殖活性檢測結果±s，n=10)

表2 各組大鼠肝細胞增殖活性檢測結果±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與GPC低劑量組比較，△P＜0.05

組別 A值 促進率(%)0.98±0.12 -GPC低劑量組 1.08±0.11 31.91±9.27 GPC中劑量組 1.18±0.13* 46.65±10.34 GPC高劑量組 1.29±0.10＊△ 58.49±12.02空白對照組△

3 討論

氧化應激是反映機體抵抗氧化損傷的一個重要指標，人體內的抗氧化系統對于消除機體高水平的氧化物，維護細胞及神經元的正常生理功能有著重要的作用。隨著年齡增長，機體清除氧自由基的酶活性降低，產生氧化應激損傷、神經元DNA損傷和記憶神經質受體的興奮性神經毒性作用，最終引起老年癡呆癥的發生和發展［4］。流行病學資料顯示膳食中補充某些植物化學物可增強機體抗氧化水平，降低衰老過程中對氧化應激的易感性，改善運動及認知行為功能，是預防老年癡呆癥的一個重要手段［5］。

GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能催化還原型谷胱甘肽變為氧化型谷胱甘肽，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，并防止過氧化物水解產生MDA。SOD可催化超氧陰離子(O2-)歧化為H2O2和O2，再經過氧化氫酶催化生成水，從而消除自由基的損害。MDA是脂質過氧化鏈式反應終止階段產生的小分子產物，其含量反映了脂質過氧化反應程度的強弱［6］。本實驗結果顯示，GPC高劑量組的SOD、GSH-Px活力較空白對照組顯著性升高，而MDA含量顯著性降低，表明GPC可增強老齡大鼠的抗氧化能力，其機制與GPC具有較強的自由基清除活性有關［7］。

細胞增殖活性水平是反映細胞生命力強弱的一個重要指標，當細胞受到生理病理因素損傷時，首先表現出增殖活性的降低［8］。MTT法通過檢測吸光度值的變化反映細胞生長及增殖活性。本次動物實驗結果顯示，GPC中、高劑量組均較空白對照組的增殖活性明顯升高，且GPC高劑量組細胞增殖促進率明顯高于低劑量GPC組。表明GPC對老齡大鼠肝細胞的增殖活性有促進作用，這與文獻報道的結果相一致［3］。

綜上研究結果認為，GPC具有增強老齡大鼠清除自由基能力，促進細胞增殖活性，提高機體抗氧化力等功效，在抗衰老和老年癡呆癥的預防和治療方面有較好應用前景。

［1］Puiggros F，Llopiz N，Ardevol A，et al.Grape seed procyanidins prevent oxidative injury by modulating the expression of antioxidant enzyme systems［J］.J Agric Food Chem，2005，53(15):6080-6086.

［2］Zhu QY，Schramm DD，Gross HB，et al.Influence of cocoa flavanols and procyanidins on free radical-induced human erythrocyte hemolysis［J］.Clin Dev Immunol，2005，12(1):27-34.

［3］鐘進義，李杰，劉輝，等.葡多酚對肝細胞內Ca2＋濃度和增殖活性的影響［J］.衛生研究，2006，35(5):567-572.

［4］王豪，瞿正萬，朱莉娜，等.阿爾茨海默病血漿總抗氧化狀態與同型半胱氨酸水平的臨床研究［J］.實用老年醫學，2011，25(1):50-55.

［5］楊亞丹，蔣與剛.老年癡呆癥營養干預的研究進展［J］.實用老年醫學，2010，24(3):248-250.

［6］Bagchi D，Ray SD，Bagchi M，et al.Mechanistic pathways of antioxidant cytoprotection by a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract［J］.Indian J Exp Biol，2002，40(6):717-726.

［7］Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39(1):44-84.

［8］Bader N，Bosy-Westphal A，Koch A，et al.Influence of vitamin C and E supplementation on oxidative stress induced by hyperbaric oxygen in healthy men［J］.Ann Nutr Metab，2006，50(3):173-176.